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1、选修一生物技术实践（基本功训练）专题1 传统发酵技术应用1.果酒和果醋制作2.腐乳制作腐乳的制作让豆腐长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制操作：以豆腐块与盐的质量比为5：1最合适。豆腐块分层放置，分层放盐，瓶口表面的盐要铺厚一些。盐的浓度低，不足以抑制微生物生长，浓度过高，影响口味及品质，表层厚铺盐是为了防止杂菌从瓶口进入。腌制时间约为8d左右。前期发酵注意：酒量控制：加酒的目的之一是杀死微生物。如果过少，达不到杀菌的目的，导致豆腐腐败；若过多，不但杀死了微生物，还会因酒精度过高抑制了酶的活性，从而影响腐乳的成熟，同时还会以酒精含量过高而影响腐乳的风味。一般应控制在12%左右。香辛料：可以调制腐
2、乳风味，也具有仿佛杀菌的作用后期发酵：主要是被杀死后的毛霉裂解释放出来的各种分解酶的作用腐乳注意：豆腐含水量以70%为宜。毛霉为异养需氧型真菌，若含水量过高，影响毛霉的有氧呼吸；若含水量过少，则不利于毛霉的生长，毛霉代谢也离不开水。) 先将豆腐切成块放在消毒的笼屉中，保持温度在15 18 ，并具有一定湿度。注意：防止杂菌污染所用器械要沸水消毒，装瓶时操作要迅速小心, 加入卤汤和辅料后，要用胶条密封,且最好将瓶口通过酒精灯的火焰,防止瓶口被污染,进而影响腐乳风味。注意：通过腌制并加入各种辅料(红曲、酒糟等)，使蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。腐乳品种不一，配料不同，发酵有快有慢
3、，通常适宜温度下一般6个月成熟。注意：加盐可以析出豆腐中水分，使豆腐变硬，在后期的制作过程中不会过早酥烂。盐能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质红方加入了红曲而呈深红色，味厚醇香；糟方因加入了酒糟而糟香扑鼻；青方因不加辅料，用豆腐本身渗出的水加盐腌制而成，绵软油滑，异臭奇香3. 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量制作泡菜并检测亚硝酸盐含量按照清水与盐的质量比为41的比例配制，并将盐水煮沸冷却。盐的作用是灭菌，深处蔬菜中过多的水分和调味作用。煮沸冷却后待用。煮沸有两大作用，一是除去水中氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。1.泡菜坛选择：应选择质地好、无裂纹、无砂眼、吸水良好、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。2
4、. 香辛料可选择辣椒、八角、桂皮、生姜、胡椒、花椒、蒜等。3. 装坛：将经过预处理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛中，装至半坛时放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满，再徐徐注入配制好的盐水，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。向坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。将封好的坛子，放在室温20 的环境中约15天便可制成清脆爽口的泡菜。选择质地鲜嫩，肉丰富，无虫咬，无烂痕，无斑点者为佳；将鲜菜修整、清洗、阳光下晾晒到菜表皮萎蔫时收起，切成条状或片状。1. 亚硝酸盐含量测定流程图：配制溶液制备标准显色液制备样品处理液比色2. 对氨基苯磺酸与亚硝酸盐发生重氮化反应；盐酸调节pH成酸
5、性；N-1-萘基乙二胺盐酸盐与重氮化反应的产物结合，生成玫瑰红色染料，作为测定亚硝酸盐含量的指示剂；氯化镉、氯化钡溶于蒸馏水并用浓盐酸酸化后作为亚硝酸盐的提取剂；氢氧化钠中和过多的盐酸，营造碱性环境；氢氧化铝作为吸附剂，使泡菜滤液脱色，变澄清；干燥后的亚硝酸钠制备相应浓度的标准显色液。注意控制温度、食盐水浓度和发酵时间。温度过高，食盐水浓度低于10%，腌制时间过短，会造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量升高，亚硝酸盐含量在10d后开始下降，食盐水浓度过高，则会使泡菜口味不佳，甚至影响乳酸菌的发酵。专题2 微生物培养与应用1.微生物纯化培养技术计算称量溶化灭菌注意：据配方计算配制一定体积培养基时各成分
6、的用量注意：倒平板时，烧杯口要通过酒精灯火焰灭菌。平板冷凝后要将平板倒置，以确保拿放方便，同时避免水分蒸发，以利微生物生长，也可防止皿盖上凝结的水滴滴入培养基，影响pH；其次防止细菌透过皿底、皿盖的缝隙，落在培养基上。倒平板时，不能将培养基溅在皿底与皿盖之间，以防止杂菌滋生，污染培养基（调PH）倒平板注意：牛肉膏较粘稠，应玻棒挑取，在称量纸上称量牛肉膏蛋白胨易吸潮，动作要迅速注意：溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦；加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度注意：由于不同微生物适宜的pH不同，因此在熔化后，必须用NaOH或HCl来调节pH接种
7、划线操作时注意：（1）用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；（2）划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾区不能相连；（3）操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。涂布操作时注意：（1）配制系列梯度稀释液时，所用的试管和移液管均需灭菌，必须用无菌水配制；（2）涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰引燃。不要将过热的涂布器放入盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；（3）配制系列梯度稀释液和转移菌液以及涂布过程等必须都在酒精灯火焰旁进行，移液管头不能接触任何物体。
8、注意：可用高压蒸汽灭菌法用干热灭菌法时温度160170(不能超过180，否则易引起报纸等燃烧)一般是培养基先灭菌再倒平板，也可先倒平板,再灭菌培养制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌注意：接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法两种。注意：将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37恒温箱中，培养12h和24h，分别观察和记录菌落特征。菌种保存注意：菌种保藏的原理是：低温、干燥和隔绝空气，使微生物代谢能力和繁殖能力降低。不同菌种的保藏方法因不同菌种而异。需氧型，必须低温有氧，而厌氧型必须低温无氧织等非；腐生微生物可提供牛肉膏蛋白胨培养基，而寄生微生物需提供活体组人工培养基，如病毒需提供活鸡胚。
9、2.土壤中分解尿素细菌分离与计数土样取样原则：人为提供有利于目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长培养基的成分：尿素作为惟一的氮源(选择培养基、固体培养基)准备选择培养基9个，牛肉膏蛋白胨培养基3个细菌计数菌种的鉴定菌落的特征包括 形状、大小、隆起程度、颜色 等方面。依据菌落特征，确定筛选出细菌类型，当菌落数目稳定时，选择菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后取平均值。并计算出样品中细菌数目。方法：检测培养基pH的变化判断原理：在细菌分解尿素时，分泌的脲酶将尿素分解为氨，氨使培养基碱性增高，pH升高。制备培养基培养观察样品稀释、取样、涂布平
10、板取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称，与其他生物环境相比，土壤的微生物数量最大，种类最多。土壤要求：土壤中富含有机质，pH接近中性。取样部位：土壤微生物主要分布在距地表38cm的近中性土壤中，约7080为细菌。培养：培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。细菌一般在3037培养12d，放线菌一般在2528培养57d，霉菌一般在2528的温度下培养34d。观察：在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。注意：实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。3.分解纤维素微生物分离土样取样挑
11、选产生透明圈的菌落进一步鉴定选择产生明显的透明圈的菌落，挑取部分细菌并接种到纤维素分解菌选择培养基上，在300C 370C培养，可获得纯化培养。为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 葡萄糖 含量进行定量测定。选择培养将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上梯度稀释选择富含纤维素的环境：如树林中多年落叶形成的腐殖土，纤维素分解菌的含量相对提高。 人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境：将富含纤维素物质如滤纸埋在土壤中，使纤维素分解菌相对聚集，埋纸深约10 cm，30天左右，从腐烂滤
12、纸上筛选纤维素分解菌。在含鉴别培养基的三个平板上分别用记号笔标记：104、105、106倍的三种稀释液，另取三个不含纤维素的培养基平板，分别用记号笔标记：104、105、106倍的三种稀释液；然后用三支l mL无菌吸管分别从104、105、106倍的三管稀释液中吸取0.1 mL对号放入已标记了稀释度的平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。将培养基平板倒置于3037 的温室中培养12天，每隔24 h观察菌落情况。（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）选择培养目的：增加纤维素分解菌浓度，确保能从样品中分离到所需微生物。选择培养原理：培养基中以纤维素为碳源，能产生纤维素酶
13、、水解纤维素的微生物能大量繁殖；不能以纤维素为碳源的微生物生长受抑制；经多次选择培养，可大大提高培养液中纤维素分解菌的比例。选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30下振荡培养12d，至培养基变混浊。用1mL无菌吸管从富集培养液中吸取1m注入盛有9mL无菌水的试管，吹吸三次，使其充分混匀，以此类推制成101、102、103、104、105、106倍的稀释液。专题3植物组织培养1.菊花组织培养制备MS培养基外植体消毒接种成分：无机物(大量元素、微量元素)、有机物：糖类(最常使用的糖是蔗糖，提供能源和维持渗透压)、维生素、氨基酸、有机添加剂
14、（生长因子）、激素pH：5.8左右灭菌：高压蒸汽灭菌注意：为降低工作量、减少误差，可通过配制母液，达到一次称量药品、多次使用。配制培养基时，母液的应用应先摇匀，移液用的移液管或量筒需清洗两次，以免造成误差。培养试管苗愈伤组织胚状体(或不定芽)脱分化再分化移栽(炼苗)栽培材料：植物的种类、年龄、保存时间消毒原因：大部分来自田间，带有大量病毒、细菌菊花茎段消毒：所用消毒剂为体积分数为70的酒精和质量分数为0.1的氯化汞溶液，所使用的清洗液是无菌水。注意：不同植株或同一植株的不同部位，所选用的消毒剂种类及浓度可能不同；方法：始终在酒精灯火焰旁进灼烧灭菌。注意：将菊花茎段插入培养基时不要倒插温度：18
15、22光照：在初期菊花的组织培养需光照，月季的花药培养不需光照(有利愈伤组织形成)，二者后期均需要光照(有利叶绿素形成和光合作用)注意：生长素和细胞分裂素的使用 使用顺序不同结果不同(先生长素，后细胞分裂素：有利于细胞分裂，但不分化先细胞分裂素，后生长素：细胞既分裂也分化同时使用： 分化频率提高) 用量比例不同发育方向不同(高：利用根的分化，抑制芽的形成低：利用芽的分化，抑制根的形成适中：促进愈伤组织的生长)注意：培养一株完整的试管苗，必须先进行生芽培养，然后进行生根培养，如果顺序颠倒，先诱导生根，就不好诱导生芽了。原因：因试管苗光合作用能力低，对不良环境耐受力差，一定要在保温、保湿一段时间以增
16、强适应力方法：流水清洗根部，移栽至消过毒的蛭石或珍珠岩环境培养脱分化阶段只分裂；再分化阶段既有分裂也有分化人工种子制备阶段对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。菊花组织培养2.月季花药培养材料选择材料消毒接种操作：花蕾体积分数70%酒精浸泡约30s无菌水清洗无菌吸水纸吸干质量分数为0.1%的氯化汞溶液2-4min（或质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液）无菌水冲洗3-5次。培养单倍体植株(鉴定和筛选)移栽、栽培1条件：无菌条件。2操作：除去萼片和花瓣，立即将花药接种到培养基上。3注意事项
17、：（1）在剥离花药时，要尽量不损伤花药，否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织；（2）去除花丝要彻底，否则与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成；（3）通常每瓶接种花药7-10个。选择处于初花期完全未开放的花蕾的花粉。1方法：镜检法。2确定花药发育时期的方法：需要对培养出来的植株作进一步的鉴定和筛选，因为在花药培养中（特别是通过愈伤组织形成的花粉植株），常常会出现染色体倍性变化。1条件：（1）温度：25左右；（2）光照：不需要。注：幼小植株形成后才需要光照。2方法：培养20-30天后，花药会开裂，长出愈伤组织或胚状体。（1）如果长出愈伤组织，则应及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生
18、植株；（2）如果释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上。月季的花药培养专题6植物有效成分提取1. 玫瑰精油提取鲜玫瑰花+清水要求：1.玫瑰花要在花开的盛期采收，大约是每年5月上、中旬。此阶段花朵含玫瑰精油最高2.玫瑰花瓣和清水的质量比为1:4；玫瑰花剪碎。水蒸气蒸馏油水混合物除水分离油层分离油层加入无水Na2SO4除水操作：1.蒸馏装置安装顺序从左到右，自上而下。拆卸仪器的顺序与安装时正好相反。2.温度计位置：使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的下限处在同一水平线上。3.冷凝管保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口
19、向下，通过橡皮管与水龙头相连。4.加热时防暴沸：垫石棉网，向液体中加几片沸石或碎瓷片。注意：蒸馏的时间和温度会影响精油的品质。为提高产品质量，要严格控制蒸馏温度，可适当延长蒸馏时间。干玫瑰花也可用萃取的方法提取玫瑰精油。收集到乳白色的乳浊液玫瑰油油水混合物加入NaCl目的增加盐的浓度使油水出现明显分层。用分液漏斗将两层分开，获得油层。注意：玫瑰花提取的芳香油是浅黄色至黄色的液体，带有甜韵的玫瑰香分液漏斗的使用方法如下：（1）首先把活塞擦干，为活塞均匀涂上一层润滑脂，注意切勿将润滑脂涂得太厚或使润滑脂进入活塞孔中，以免污染萃取液。（2）塞好活塞后，把活塞旋转几圈，使润滑脂分布均匀。并用水检查分液
20、漏斗的顶塞与活塞处是否渗漏，确认不漏水后再使用。（3）将分液漏斗放置在大小合适的、并已固定在铁架台上的铁圈中，关好活塞。将待分离的液体从上部开口处倒入漏斗中，塞紧顶塞，注意顶塞不能涂润滑脂。（4）取下分液漏斗，用右手手掌顶住漏斗顶塞并握住漏斗颈，左手握住漏斗活塞处，大拇指压紧活塞，将分液漏斗略倾斜，前后振荡（开始振荡时要慢）。（5）振荡后，使漏斗口仍保持原倾斜状态，左手仍握在漏斗活塞处，下部管口指向无人处，用拇指和食指旋开活塞，使其释放出漏斗内的蒸气或产生的气体，以使内外压力平衡，这一步操作也称做“放气”。（6）重复上述操作，直至分液漏斗中只放出很少的气体时为止。再将分液漏斗剧烈振荡23 mi
21、n，然后将漏斗放回铁圈中，待液体静置分层。玫瑰精油的提取2.橘皮精油提取橘皮干燥石灰水浸泡新鲜的橘皮中含有大量的果蜡、果胶和水分，直接压榨，出油率较低。为提高出油率，需将柑橘皮干燥去水。漂洗压榨过滤静置再次过滤流水充分漂洗，洗去残留的石灰水。用石灰水浸泡，时间为10h以上。石灰水的作用是破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率。压榨是一个机械加压过程，既要压紧，防止原料滑脱，又要将油分挤压出来。压榨前沥干水分并粉碎，压榨时还要分别加入相当于橘皮质量的0.25%的小苏打和5%的硫酸钠，目的是使橘皮油易于和水分离，并调节pH至78。无色透明，有诱人的橘香味，主要成分是柠檬烯。橘皮油将
22、分离的产品放在510的冰箱中静置57天，使杂质沉淀。先用普通布袋过滤除去固体物和残渣，然后离心进一步除去质量较小的残留固体物，再用分液漏斗或吸管将上层的橘皮油分离出来。滤液和吸出的上层橘皮油合并，即获得最终的橘皮精油。用吸管吸出上层澄清橘皮油，剩余部分用滤纸过滤，取滤液。出油率的计算：橘皮精油的提取3.胡萝卜素提取胡萝卜粉碎目的：便于胡萝卜素能充分溶解。注意：颗粒要小干燥萃取过滤浓缩胡萝卜素目的：除去水分注意：干燥时要注意控制温度时间。温度太高、干燥时间太长会导致胡萝卜素的分解。目的：使胡萝卜素充分溶解注意：不能明火加热原因：有机溶剂都是易燃物，直接使用明火易引起燃烧、爆炸。冷凝回流，防萃取液
23、挥发影响因素：主要是萃取剂的性质和量；其次是原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度、萃取时间的长短等目的：除去颗粒等杂质目的：除去有机溶剂 装置：蒸馏装置注意：不能明火加热收集瓶口可用锡箔或牛皮纸遮盖胡萝卜素粗品的鉴定方法：纸层析法，原理：混合物各组分在层析液中的溶解度不同，随层析液在滤纸上的扩散速度不同，溶解度大的随层析液在滤纸上的扩散速度快，反之则慢，这样，同一种物质在滤纸上的扩散速度相同，最终位置也相同。流程：量作基线：下端距底边2cm处划基线，在基线上取A、B、C、D四个点对照点样：在A、D点点标准样品，B、C点点提取样品干燥层析：吹干滤纸溶剂，放入层析容器中层析对比观察：对比观
24、察样品色素点与标准色素点的异同。结果分析：如果萃取样品中出现了和标准样品一样的层析带，说明提取胡萝卜素的实验成功。由于提取物中含有杂质，萃取样品的颜色可能比标准样品的颜色浅，我们也可以通过颜色的比较，初步确定提取的胡萝卜素的量。注意：选择干燥的滤纸，为防止操作时滤纸的污染，应尽量避免用手直接接触滤纸，可以戴手套进行操作点样时应注意点样斑点不能太大(直径应小于0.5cm)，如果用吹风机吹干，温度不宜太高，否则斑点会变黄卷纸时注意滤纸两边不能互相接触，以免因毛细现象导致溶剂沿滤纸两边的移动加快，溶剂前沿不齐，影响效果层析时，不要让层析液没及样品原点，防止胡萝卜素溶解在层析液中，实验失败。萃取剂的选择（1）有机溶剂的分类：分为水溶性（如乙醇和丙酮）和水不溶性（如石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、四氯化碳）两类。多数对人体有一定毒性。（2）选取萃取胡萝卜素的有机溶剂的原则：具有较高的熔点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶；萃取效率高；对人无毒、不易燃、易与产品分离、不影响产品质量萃取胡萝卜素的有机溶剂应该具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素且不与水混溶。另外，还要考虑对人体是否有毒性等安全问题。因乙醚的沸点较低，苯和四氯化碳对人体有毒性，所以本实验选用石油醚或乙酸乙酯作为萃取剂。胡萝 卜 素 的 提 取