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1、-实验二 SDSPAGE 蛋白电泳分析一、 目的掌握 SDS-PAGE 电泳原理与方法二、 电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称 Acr) 和交联剂 N，N亚甲基双丙烯酰胺（简称 Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。 SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身
2、原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称 SDSPAGE）。由于 SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么 SDSPAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。三、 试剂配制1 30% 丙烯酰胺：将 29g 丙烯酰胺和 1g N，N-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为
3、60ml 的水中。加热至 37溶解之，补加水至终体积为 100ml。用过滤器（0.45m 孔径）过滤除菌，查证该溶液的 pH值应不大于 7.0，置棕色瓶中保存于室温 (丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。2 1M Tris-Cl: 称取 12.191g Tris 碱溶于 80ml 蒸馏水中，用浓 HCl 调到所需 pH 值，定容至 100ml。1.5M：Tris 碱 18.15g 去离子水 80ml 浓盐酸调 PH 值 8.8 加去离子水定容至 10
4、0ml3 1 M DTT：称取 3.09 g DTT，加入到 50 ml 塑料离心管内，加 20 ml 的 0.01 M NaOAc（pH5.2)，溶解后使用 0.22 mm 滤器过滤除菌适量分成小份后，-20保存。4 10% SDS: 20g SDS 溶于 200ml 纯水中。5 10% 过硫酸铵：1g 过硫酸铵溶于 10ml 纯水中，现用现配。6 2SDS 上样缓冲液：1.0 mol/L Tris-Cl(pH6.8)10ml，10%SDS 40ml，50%甘油 40ml，0.2g 溴芬蓝，定容至 100ml。7 10Tris-甘氨酸电泳缓冲液，3g Tris 碱和 18.8g 甘氨酸，加入
5、 10ml 10%SDS，用去离子水补至100ml，配制成 10Tris-甘氨酸电泳缓冲液；取 50ml 10缓冲液，稀释至 500ml，配制成工作浓度1Tris-甘氨酸电泳缓冲液。8 考马斯亮蓝 R250 染色液：1gR250 溶于 250ml 异丙醇、100ml 冰乙酸和 650ml 去离子水的混合液中，过滤去除颗粒状物。9 脱色液：乙醇/水/冰乙酸分别为 50ml,850ml 和 100ml。四、 实验方法110%分离胶的配制 7ml(小板为 5ml)：按附录添加适量的试剂，立即倒胶，加水封胶待凝固。2吸干封液的水，倒浓缩胶。3. 5%浓缩胶的配制 3ml：按附录添加适量的试剂，立即倒胶，插入梳子待凝固。3取下梳子，用蒸馏水冲洗梳孔，洗净其中的残余胶块，用滤纸吸干。4将制成的胶放入电泳槽内，倒入 1甘氨酸电泳缓冲液，观察不渗漏即可。5取 10l 样品，加入等体积的 2SDS 上样缓冲液，样品与蛋白质 Maker 100保温 5min。6 分别取 10l 上样，110V 恒压电泳 23 小时。7 将胶剥下至一平皿中，加入考马斯亮蓝染色 12 小时，回收染色液后，倒入脱色液脱色过夜，其间换脱色液 12 次。五、 实验结果观察电泳结果，分析蛋白大小，结合实验一，通过蛋白条带的变化分析细胞破碎效果六、 见附录 1：分离胶和浓缩胶配方表第 7 页-