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1、-植物保物研究方法论文题 目：RAPD在昆虫分类学中的应用学院(系)：植物保护学院专业年级：植物病理学学生姓名：杜友伟学 号：2016050129指导教师：胡祖庆 RAPD技术在昆虫分类学中的应用摘要：传统昆虫分类学主要从昆虫形态特征着手,是进行昆虫分类的主要方法，但形态分类的方法在较低的分类阶元中有着较大的局限性。近年来分子生物学技术同传统分类学方法相结合,在昆虫分类学研究中得到广泛的应用。随机扩增多态性DNA(RAPD)技术简便快捷、费用低、灵敏度高、对模板纯度要求不高、能充分反映模板的多态性等技术优势；但同时该技术稳定性和可重复性差、不能对纯合体杂合体加以区分、存在共迁移问题等不足之处；
2、近年来国内外RAPD技术主要在同翅目、蜚蠊目、双翅目、鳞翅目、直翅目、鞘翅目等昆虫的分类鉴定及昆虫系统发育分析中应用。RAPD技术扩展了分子生物学技术在昆虫分类学的应用范围，该技术的成功应用,极大地提高了昆虫分类学研究的水平,并且随着技术手段的不断进步有着更为广阔的应用前景。关键词：RAPD，昆虫分类学，技术1、 昆虫分类学昆虫分类学是昆虫学和动物分类学的分支学科，是研究昆虫类别及其异同和历史渊源关系，并据以建立分类系统，以总结进化历史，反映自然系谱的一门基础学科1。其主要内容包括答定、分类、系统发育。以研究基因结构和功能为主的现代分子生物学和以DNA重组技术为核心的生物技术研究在本世纪取得了
3、突飞猛进的发展，预示着分子生物学和现代生物技术将成为世纪的新兴重点学科。近十多年来，我国昆虫分类工作者应用的新技术新方法日益增多,特别是现代生物技术使得昆虫分子系统学的研究成为可能。2、 RAPD随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术是1990年美国杜邦公司的williams2和加利福尼亚生物研究所的welsh3领导的2个小组几乎在同时发展起来的。它的主要技术基础是DNA聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，以一种或多种人工合成的随机引物来对模板DNA进行PCR扩增，再进行电泳分离和对DNA
4、片段染色，由于不同物种的基冈组中与引物相匹配的碱基序列的位置和数量都可能不同，所以扩增产物的大小也有不同，扩增片段DNA的多态性也就反映了模版DNA的多态性，从而可以通过多态性的比较，应用于昆虫物种的鉴定和系统发育关系的研究中。RAPD操作简便快捷，技术容易掌握，自动化程度高。RAPD技术中使用的主要仪器为现在实验室里常见的PCR仪，使得模版DNA扩增过程实现自动化，大大降低了研究费用。其次，RAPD能够对整个模版DNA进行标记，有很大的随机性，可充分展现出模版DNA的多态性。因此，它能够在没有任何分子遗传背景的情况下，分析模版DNA的多态性。2.1 RAPD技术的优势RAPD操作简便快捷，技
5、术容易掌握，自动化程度高。RAPD技术中使用的主要仪器为现在实验室里常见的PCR仪，使得模版DNA扩增过程实现自动化，大大降低了研究费用。其次，RAPD能够对整个模版DNA进行标记，有很大的随机性，可充分展现出模版DNA的多态性4。因此，它能够在没有任何分子遗传背景的情况下，分析模版DNA的多态性。同时，RAPD的引物丰富，其采用的引物是随机引物，常由10个寡核苷酸组成，引物可人工合成，很多公司都能生产。目前RAPD引物已经有千余种，可以针对不同模版DNA来选取不同的引物。另外，RAPD技术中模版DNA用量少。PCR扩增时仅需模版DNA 20100g，灵敏度高，扩增时，引物一个碱基的变化都可能
6、引起扩增谱带的巨大变化。该技术对模版DNA的纯度要求不高也是其优点之一。Barro等5的研究表明酒精保存的标本和干制标本都可用于RAPD分析。模版中混有少量的RNA或蛋白质对扩增结果几乎没有影响。这就可以省略提取模版DNA过程中的一些纯化过程，减少了模版DNA的损失6，适用于小型昆虫模版DNA的提取。2.2 RAPD技术的不足之处RAPD技术受环境影响的因素较多，因而试验稳定性和可重复性较差。RAPD分析中重复性不太高的原因是在PCR反应中会产生一些扩增产物的改变。并且，不同的研究者采用的程序不同，或者即使设置相同的反应程序，但所使用的仪器类型试剂和耗材在不同厂家间也有差异，从而扩增产物也会受
7、到影响。此外还有模版DNA的完整性、PCR的变性温度、Taq酶的选择、Mg2+的浓度、外源DNA的污染等因素都可以对RAPD结果产生影响。值得注意的是，在扩增反应过程中，引物的熔点值较低也是RAPD实验结果的可重复性差的一个重要原因：其反应易受环境条件的影响，导致引物降解，扩增失败7。从适用范围来看，由于RAPD标记为显性标记，虽符合孟德尔遗传定律，但不能区分纯合体和杂合体基因型，故而在遗传分析和构建遗传图谱等方面受到了一定限制。此外从电泳效果来看，该技术存在共迁移问题。在不同个体的PCR产物出现分子量大小相同的条带，并不能保证这些个体拥有同源的片段，这些条带也有可能包含了不同的扩增产物。因为
8、所用的凝胶电泳类型(一般是琼脂糖凝胶电泳)只能分开不同分子量的片段，而不能分开分子量相同但碱基序列不同的片段8。正是由于RAPD技术有着上述的局限性，因而在进行同一项研究工作时需要注意所选用的试剂、配制的反应体系、所用的引物、反应程序、染色条件等因素必须严格一致并要选用优良的电泳设备。3、 讨论RAPD技术具有简便快捷的特点，而且其灵敏程度很高，能够对整个基因组作地毯式的多态分析。同时，RAPD技术还可以和其它DNA分子技术结合，这样就在很大程度上扩展了分子生物学技术在昆虫分类学研究中的应用范围并使之得到了极大的发展。RAPD技术的成功应用，极大地提高了昆虫分类学研究的水平，在揭示昆虫的系统发
9、育关系、保护昆虫的生物多样性、合理利用昆虫资源、害虫的综合治理等方面都起到了重要作用。综上所述，RAPD技术在昆虫分类学研究中的应用前景巨大,并将随着技术手段的不断完善变得更加广阔。参考文献1 黄帅, 胡红英. 分子生物学技术在昆虫系统学上的应用 J. 新疆大学学报(自然科学版), 2006, 03: 319-323.2 Wi11iams J G K, Kubelik A R, Livak K J, etal. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markersJ.Nucleic Acid
10、s Res, 1990, 18(22):6531-6535.3 Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR With arbitrary primersJ. Nucleic Acids Res, 1990, 18(24): 7213-7218.4Hoy M A. Molecular GeneticsM. California: Academy press, 1994: 388-390.5Barro P J D, Driver F. Use of RAPD PCR to distinguish the B biotype fro
11、m other biotypes of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera; Aleyrodidae)J. Aus J of Ento, 1997, 36: 149-152.6 汪小全, 邹俞苹, 张大明, 等. RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题J. 植物学报, 1996, 38(12): 954-962.7 朱元娣, 李光晨, 张文, 等. 苹果RAPD标记的引物筛选与RAPD校正J. 中国农业大学学报, 2003, 8(3): 7-10.8 黎裕, 贾继增, 王天宇. 分子标记的种类及其发展J. 生物技术通报, 1999, 4: 19-22.第 9 页-