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1、动物微生物学试验指导指导老师：郭春秋 李娜目 录试验1细菌的简洁染色与革兰氏染色试验2细菌的芽胞, 荚膜, 鞭毛染色及运动性视察试验3 微生物细胞形态及菌落特征视察试验4培育基制作, 灭菌消毒及无菌操作接种技术试验5微生物的分别纯化与稀释平板菌落计数试验6微生物细胞大小测定及显微镜干脆计数附录1 常用培育基配方附录2 常用染色液的配制附录3 常用试剂与指示剂的配制参考书目试验1细菌的简洁染色与革兰氏染色一, 试验目的1、 学习细菌的简洁染色法与革兰氏染色法；2、 学习显微镜油镜视察的方法；二, 试验内容1、 细菌的简洁染色；2、 细菌的革兰氏染色；三, 试验原理简洁染色法是一种最基本的染色方法
2、，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性, 碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而碱性染料的离子带正电荷，能与带负电荷的物质结合。所以通常采纳碱性染料（如美蓝, 结晶紫, 碱性复红, 孔雀绿或蕃红）等进行染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使菌体着色。简洁染色一般难于区分细菌细胞的构造。革兰氏染色法是细菌学中广泛运用的重要鉴别染色反应。通过革兰氏染色法可将全部的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）与革兰氏阴性菌（G）两大类。这是因为两类菌的细胞壁结构与成分的不同，G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄, 交联度低，故用乙醇或丙酮脱
3、色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫与碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经过蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，即紫色。四, 试验材料1, 活材料：培育1216h的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）, 枯草杆菌（Bacillus subtilis）, 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），培育24h 的大肠杆菌（Escherichia coli）。2, 染色液与试剂：结晶紫, 卢哥氏碘液, 95%酒精, 蕃红
4、, 复红, 二甲苯, 香柏油。五, 试验用品废液缸, 洗瓶, 载玻片, 接种杯, 酒精灯, 擦镜纸, 吸水纸, 滴管, 玻片搁架, 镊子, 无菌水, 75%乙醇浸泡的消毒棉球, 盛有75%乙醇的玻片回收缸, 生物显微镜等。六, 试验方法（一）简洁染色1, 涂片：用消毒棉球擦拭双手，用镊子取干净载玻片一块，在载玻片的左, 右两端各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金芽胞杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块，挑刚制成的苏云金芽胞杆菌浓菌悬液23环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取23环涂在右边制成薄涂面。亦可干脆在载玻片上制薄的涂面，留意取菌不要太多。2, 晾
5、干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。是否还有其它方法？3, 固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰23次固定，以不烫手为宜。为什么要进行该步骤？4, 染色：用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色12min。5, 水洗：水洗去涂片上的染色液。6, 干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，勿将菌体擦掉。7, 镜检：先低倍视察，再高倍视察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中细致调焦视察细菌的形态。怎样操作才能做到既快而又不易损坏玻片地调准焦距？（二）革兰氏染色1, 涂片：涂片方法与简洁染色涂片法相同。涂片厚薄对结果有影响吗？2
6、, 晾干：与简洁染色法相同。3, 固定：与简洁染色法相同。4, 结晶紫初染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量的结晶紫染色液染色1min，以盖满细菌涂面为宜。之后倾去染色液，用水当心地冲洗。 5, 碘液媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min后用水洗去碘液。此步可否省去？ 6, 脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇，脱色2025s至流出液无色，马上水洗。为什么要马上水洗？7, 复染：滴加蕃红复染25min，然后用水洗去涂片上的番红染色液。 8, 晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。9, 镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最终用油镜视察，并推断菌体的革兰氏染色反应性。10, 试验完毕后的处
7、理 将浸过油的镜头按下述方法擦试干净:先用擦镜纸将油镜头上的油擦去；用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次；再用干净的擦镜纸将镜头擦23次，留意擦镜头时向一个方向擦试。 视察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，并放入盛有75%乙醇溶液的回收缸中。 显微镜复原并做好运用状况登记。七, 作业与思索（一）, 绘图1、 简洁染色后绘出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）, 枯草杆菌（Bacillus subtilis）, 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）与大肠杆菌（Escherichia coli）的形态图。2、 革兰氏染色后绘图并注明金黄色葡萄球菌（S
8、taphylococcus aureus）与大肠杆菌（Escherichia coli）两菌的革兰氏染色的反应性。（二）思索题1、 在取菌涂片的过程中怎样操作才能保证斜面菌种不受到污染？2、 革兰氏染色反应成败的关键操作是哪一步？为什么？3、 为什么革兰氏染色法要选用幼龄菌种？试验2细菌的芽胞, 荚膜, 鞭毛染色及运动性视察一, 试验目的1、 学习并驾驭细菌芽胞染色法，初步了解芽胞杆菌的形态特征；2、 学习并驾驭细菌荚膜染色法；3、 学习并初步驾驭细菌鞭毛染色法，视察细菌鞭毛的形态特征；4、 学习用压滴法与悬滴法视察细菌的运动性。二, 试验内容1、 细菌芽胞染色；2、 细菌荚膜染色；3、 细菌
9、鞭毛染色；4、 细菌的运动性视察。三, 试验原理细菌的芽胞壁较细胞壁厚而致密，透性低，不易着色，也不易脱色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色，芽胞呈无色透亮状。芽胞染色法就是基于细菌的芽胞与菌体对染料的亲与力不同，用不同的染料进行着色，使芽胞与菌体呈现不同的颜色而加以区分。全部的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还须要加热，以促进芽胞着色。当芽胞着色时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。再用对比度强的染料对菌体复染，使菌体与芽胞呈现出不同的颜色，形成显明的比照，便于视察。荚膜是包在细菌细胞壁外面的一层黏胶状或胶质状物质，成分为多糖, 糖蛋白
10、或多肽，与染料间的亲与力弱，不易着色，故通常采纳负染色法染荚膜，即设法使菌体与背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体四周呈一浅色或无色的透亮圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形，影响视察结果。细菌的鞭毛极细，直径一般为1020nm ,超过了一般光学显微镜的辨别力，只有用电子显微镜才能视察到。但是，如采纳特殊的染色法，将鞭毛直径加粗，则在一般光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色的方法许多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸与氯化高铁或钾明矾等配制而成。细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定重
11、要特征之一。采纳鞭毛染色法虽能视察到鞭毛的形态, 着生位置与数目，但此法既费时又麻烦。假如只需查清供试菌是否有鞭毛，可采纳悬滴法或水封片法即压滴法，干脆在光学显微镜下检查活细菌是否具有运动实力，以此来推断细菌是否有鞭毛。此法较快速, 简便。悬滴法就是将菌液滴加在干净的盖玻片中心，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中心，即可放置在一般光学显微镜下视察。水封片法是将菌液滴在一般的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下视察。细菌依靠鞭毛的运动方式，与鞭毛的排列形式与数目有关，但依据细菌的运动方式，对鞭毛的数目与排列方式只能作大致推断。单毛菌与丛毛菌多做直线运动，周毛菌多做翻转运动。依靠鞭
12、毛的运动称为真性运动。无鞭毛细菌做左右抖动而不变更其位置，这种运动称为非真性运动，亦称布朗运动。四, 试验材料1, 活材料：培育36h的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）；培育35d的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”），该菌在甘露醇作碳源的培育基上生长时，荚膜丰厚；培育1216h 的水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae ），黏质赛氏杆菌（Serratia marcescens ）或荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens ）斜面菌种；培育12
13、16h的枯草杆菌（Bacillus subtilis）, 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）以及荧光假单胞菌（Pseudomonas Fluorescens）。2, 染色液与试剂：5%孔雀绿水溶液, 0.5%番红水溶液；Tyler法染色液, 用滤纸过滤后的绘图墨水, 复红染色液, 黑素, 6%葡萄糖水溶液, 1%甲基紫水溶液, 甲醇, 20%CUSO4水溶液；硝酸银染色液（包括A液与B液，）, Leifson 染色液；香柏油, 二甲苯。五, 试验用品小试管（75mm10mm）, 烧杯（300mL）, 载玻片, 凹载玻片, 盖玻片, 滴管, 废液缸, 玻片搁架, 接种环
14、, 擦镜纸, 吸水纸, 镊子, 记号笔, 洗瓶, 凡士林, 无菌水, 水浴锅, 生物显微镜等。 六, 试验方法（一）细菌芽胞染色1, 改良的Schaeffer与Fulton氏染色法制备菌液：加12滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取23环菌体于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。为什么要制成浓稠的菌液？加染色液：加5%孔雀绿水溶液23滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。加热：将此试管浸于沸水浴，加热1520min。涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于干净的载玻片上，做成涂面，晾干。固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。复染：加番红水溶液染色5
15、min后，倾去染色液，不用水洗，干脆用吸水纸吸干。镜检：先低倍，再高倍，最终用油镜视察。结果：芽胞呈绿色，芽胞囊与菌体为红色。2, Schaeffer与Fulton氏染色法涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过23次。染色：加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后，将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时起先计算时间，约维持1520min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干枯。加热时温度可否太高？水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。复染：用番红液染色5min。水洗, 晾干或吸干。镜检：
16、先低倍, 再高倍，最终在油镜下视察芽胞与菌体的形态。结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。（二）细菌荚膜染色细菌荚膜染色方法许多，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。1, 负染色法制片：取干净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取23环菌体放入水滴中混匀并涂布。干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。为什么不能在火焰上方烘干？染色：在涂面上加复红染色液染色23min。水洗：用水洗去复红染液。干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上
17、成为一薄层，并快速风干。镜检：先低倍镜，再高倍镜视察。结果：背景灰色，菌体红色，荚膜无色透亮。2, 湿墨水法制菌液：加1滴墨水于干净的载玻片上，挑23环菌体与其充分混合匀称。加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。加盖玻片时勿留气泡，以免影响视察。镜检：先用低倍镜, 再用高倍镜视察。结果，背景灰色，菌体较暗，在其四周呈现一光明的透亮圈即为荚膜。3, 干墨水法制菌液：加1滴6%葡萄糖液于干净载玻片一端，挑23环胶质芽胞杆菌，与葡萄糖液充分混合，再加1环墨水，充分混匀。为什么加6%葡萄糖液？制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边
18、与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，快速而匀称地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。干燥：空气中自然干燥。固定：用甲醇浸没涂片，固定1min，马上倾去甲醇。干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。染色：用甲基紫染12min。水洗：用自来水轻洗，自然干燥。镜检：先用低倍镜视察，再用高倍镜视察。结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清楚透亮圈。4, Tyler法涂片：按常规法涂片，可挑23环菌体与水充分混合，并将黏稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。干燥：在空气中自然干燥。染色：用Tyler染色液染57min。脱色：用20%CUCO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度，冲洗2遍即可。用吸水纸
19、吸干，并马上加12滴香柏油于涂片处，以防止CUCO4结晶的形成。为什么是用20%CUCO4脱色，而不是用水洗脱色？镜检：先用低倍镜视察，再用高倍镜视察。视察完毕后留意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。（三）细菌鞭毛染色1, 镀银法染色清洗玻片选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避开玻片相互重迭，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中，洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒，煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗, 晾干，再放入浓洗液中浸泡56天。浓洗液的成分是：重铬酸钾60g ,浓硫酸460mL ,水300mL；配制方法是：重铬酸钾溶解在
20、温水中，冷却后再缓缓加入浓硫酸。运用前取出玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。菌液的制备及制片菌龄较老的细菌简洁脱落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培育基斜面上连续移接35代，要求培育基表面潮湿，斜面基部含有冷凝水，以增加细菌的运动力。最终一代菌种放恒温箱中培育1216h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液35环，移至盛有12mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37恒温箱中静置10min。放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落，让幼龄菌的鞭毛松绽开。然后，吸取少量菌液滴在干净玻片的一端，马上将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一
21、端，用吸水纸吸去多余的菌液。让涂片自然干燥。用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培育基培育。方法是将0.30.4%的琼脂牛肉膏培育基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后，在平板中心点接活化了34代的细菌，恒温培育1216h后，取扩散菌落边缘的菌体制作涂片。染色滴加A液，染46min。用蒸馏水充分洗净A液。用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.51min，加热时应随时补充蒸发掉的染料，不行使玻片出现干枯区。用蒸馏水洗，自然干燥。镜检：先低倍，再高倍，最终用油镜检查。结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。2, 改良Leifson染色法清洗玻片法同前。配制染料：见附录2-9。染料配好
22、后要过滤1520次后染色效果才好。菌液的制备及涂片。菌液的制备同前。用记号笔在干净的玻片上划分34个相等的区域。放1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。干燥在空气中自然干燥。染色加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，依此类推，相隔时间可自行确定，其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。水洗：在没有倾去染料的状况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。干燥：自然干燥。镜检：先低倍视察，再高倍视察，最终再用油镜视察，视察时要多找一些视野，不要希望在12个视野中就能看到细菌的鞭毛。结果：菌体与鞭毛均染成红色。（四）
23、细菌的运动性视察1, 制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加34mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。2, 涂凡士林：取干净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。3, 滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中心，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜视察时，易于找寻菌液的位置。4, 盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中心的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中心，再用铅笔或火柴棒轻轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥（图2-1）。若制水浸片，在载玻片上滴加一滴菌液，盖上盖玻片后即可置显微镜下视察。图2-1 悬滴标本的制备（自黄秀梨）5, 镜检：先用低倍
24、镜找到标记，再略微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中心高倍镜视察。由于菌体是透亮的，镜检时 可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于视察。镜检时要细致区分是细菌的运动，还是分子作布朗运动，前者在视野下可见细菌自一处游动至它处，而后者仅在原处左右摇摆。细菌的运动速度依菌种不同而异，应细致视察。结果：有鞭毛的枯草杆菌与假单胞菌可看到活跃的活动，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌不运动。七, 作业与思索（一）绘图：绘出所用材料的芽胞与菌体的形态图；绘出Bacillus mucilaginosus的荚膜与菌体形态图，并注明各部位的名称；绘出鞭毛菌的形态图；绘出所看到的细菌的形态图，并用箭头表示
25、其运动方向。（二）思索题1, 用简洁染色法能否视察到细菌的芽胞？2, 若涂片中视察到的只是大量游离芽胞，很少看到芽胞囊及养分细胞，你认为这是什么缘由？3, 通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里的菌体着色而荚膜不着色？4, 用鞭毛染色法精确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要留意哪些环节？5, 悬滴法中，为什么要涂凡士林？为什么加的菌液不能太多？假如发觉显微镜视野内大量细菌向一个方向流淌，你认为是什么缘由造成的？试验3 微生物细胞形态及菌落特征视察一, 试验目的1, 学习用放线菌的玻璃纸培育物视察放线菌的个体形态；2, 学习插片培育法视察放线菌形态；3, 学习放线菌的印片染色法；4, 学习自制水浸片
26、视察霉菌的形态；5, 学习酵母菌子囊孢子的培育及视察方法；6, 初步驾驭四大类微生物的菌落特征，学会从菌落特征识别四大类微生物的方法。二, 试验内容1、 用玻璃纸琼脂平板透析培育法视察放线菌形态；2、 用插片培育法视察放线菌形态；3、 放线菌的印片染色法；4、 霉菌水浸标本片的制备与视察；5、 酵母菌子囊孢子的培育与视察；6, 微生物菌落特征视察微生物菌落特征视察。三, 试验原理放线菌自然生长的个体形态视察，目前多采纳玻璃纸琼脂透析培育法。玻璃纸具有半透膜特性，其透光性与载玻片基本相同，采纳玻璃纸琼脂平板透析培育，能使放线菌生长在玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取小片，贴放在载玻片上，用显微镜镜
27、检可视察到自然生长的放线菌个体形态。另外，采纳插片培育法也能视察放线菌的个体形态。放线菌的孢子丝形态与孢子排列状况是放线菌分类的重要依据，为了不打乱孢子的排列状况，常用印片法进行制片视察。现在，放线菌孢子的排列与孢子的表面形态是用电子显微镜来进行视察的。霉菌的养分体是分枝的丝状体。其个体比细菌与放细菌大得多，分为基内菌丝与气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖菌丝，不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。酵母菌的有性繁殖一般产生子囊孢子。其形成过程为：两养分细胞各伸出一个小突起而相接触，使两个细胞结合起来，而后接触处的细胞溶解，经质配与核配后，形成双倍体核，原来的细胞形成合子。此双倍体细胞可以进行芽
28、殖。在相宜条件下，合子减数分裂，双倍体核分裂成48个单倍体核，核外再围以原生质渐渐形成子囊孢子，子囊孢子包含在由母细胞壁演化而来的子囊即原来的二倍体细胞中。子囊孢子的形成与否及其数量与形态，是鉴定酵母菌的依据之一。将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）从养分丰富的培育基上移植到含有醋酸钠与葡萄糖或棉籽糖的产孢培育基上，于适温下培育，即可诱导其子囊孢子的形成。本试验即以酿酒酵母为材料视察酵母菌的子囊孢子。区分与识别各大类微生物通常包括菌落特征与个体形态的视察。由于微生物个体形态结构, 分裂方式, 运动实力, 生理特征以及产生色素等实力的不同，因而在固体培育基上生长的菌落各
29、有特点。微生物的个体形态是菌落特征的基础，而菌落特征又是个体形态的集中反应。每一大类微生物都有其独特的细胞形态，故它们在肯定的培育条件下都有各自的菌落特征，即它们的菌落在形态, 大小, 色泽, 透亮度, 粘稠度, 边缘状况等都有明显的差异。一般依据这些差异就能识别四大类微生物。此法简便快速，在科研与生产中常可采纳。四, 试验材料1, 活材料：细菌：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；放线菌：灰色链霉菌（Streptomyces griseus ），培育57d 的紫色直丝链霉菌（Streptomyces uiolaceore
30、ctus），吸水链霉菌“5102”（Streptomyces hygroscopicus var. Yingchengensis（5102）；酵母菌：酿酒酵母（Saccharomyces cereuisiae），产朊假丝酵母(Candida utilis)；霉菌：桔青霉（Penicillum citrinum）, 黑曲霉（Aspergillus niger）等；2, 培育基：高氏一号琼脂培育基。马铃薯琼脂培育基, 克氏培育基或麦氏培育基的试管斜面, 3, 试剂：石炭酸复红染色液, 乳酸石炭酸棉蓝染色液, 50%酒精（V/V）, 3%的酸性酒精, 美蓝染色液, 50g/L的KOH溶液, 碘液,
31、1%碳酸氢钠溶液, 甲基绿。五, 试验用品无菌平皿, 玻璃纸, 9mL无菌水若干支, 酒精灯, 火柴, 接种环, 玻璃刮铲, 1mL无菌吸管, 剪刀, 小刀, 有凹窝的载玻片, 载玻片, 盖玻片, 解剖针, 镊子, 滴管, 玻璃瓶, 天平, pH试纸, 试管, 玻璃缸, 培育皿, 药棉, 放大镜, 生物显微镜等。六, 试验方法（一）用玻璃纸琼脂平板透析培育法视察放线菌形态1, 将玻璃纸剪成培育皿大小，用旧报纸隔层迭好后灭菌。2, 将放线菌斜面菌种制成103的孢子悬液。3, 将高氏一号琼脂培育基熔化后在火焰旁倒入无菌培育皿内，每皿倒15mL左右，待培育基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸覆盖
32、在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培育基。4, 分别用1mL无菌吸管取0.2mL吸水链霉菌“5102”孢子悬液, 紫色直丝链霉菌孢子悬液分别滴加在两个玻璃纸琼脂平板培育基上，并用无菌玻璃刮铲涂抹匀称。5, 将接种的玻璃纸琼脂平板置2830下培育。6, 在培育至3d ，5d ，7d 时，从温室中取出平皿。在无菌环境下。打开培育皿，用无菌镊子将玻璃纸与培育基分别，用无菌剪刀取小片置于载玻片上用显微镜视察。可见到放线菌的基内菌丝, 气生菌丝与孢子丝。（二）放线菌的插片培育法放线菌的插片培育是将放线菌菌种制成孢子悬液，浓度以102103为好，取0.2mL放在适合放线菌生长的平板培育基上，用玻璃刮铲涂布匀
33、称，然后将灭过菌的盖玻片斜插入固体培育基中，置2832下培育，35d 后取出盖玻片放在载玻片上镜检，可见自然生长的放线菌个体形态。可见到放线菌的基内菌丝, 气生菌丝与孢子丝。（三）放线菌的印片染色法1, 制片：取干净载玻片一块，用小刀切取放细菌培育体一块，应带培育基切下，放在载玻片上，用另一载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻按压，然后将载玻片垂直拿起。留意不要使培育体在玻片上滑动，否则会打乱孢子丝的自然形态。2, 固定：将印有放线菌的涂面朝上，通过酒精灯火焰23次加热固定。3, 染色：用石炭酸复红染色液染色1min。然后水洗，晾干。可否用吸水纸吸干4, 镜检：先用低倍镜，后用高倍镜，最终用油镜视察，
34、可见孢子丝, 孢子的形态及孢子排列状况。（四）霉菌水浸标本片的制备与视察在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水，用解剖针或镊子从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢子的霉菌菌丝，用50%的乙醇浸润，再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，细致地用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片，勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片，先用低倍镜视察，必要时转换高倍镜镜检，并记录视察结果。（五）酵母菌子囊孢子的培育与视察1, 子囊孢子的培育：将酿酒酵母用马铃薯培育基活化23代后，转接于克氏或麦氏斜面培育基上，于25培育35d ，即可形成子囊孢子。2, 制片与视察：于载玻片上加蒸馏水一滴，取子囊孢子
35、培育体少许放入水滴中制成涂片，干燥固定后用石炭酸复红染色液加热染色510min,不能沸腾，倾去染液，用酸性酒精冲洗3060s脱色，再用水洗去酒精，最终加美蓝染色液染色，510s 后用水洗去染液，用吸水纸吸干后置显微镜下镜检。子囊孢子为红色，菌体为青色。亦可不经染色干脆制水浸片视察。水浸片中的酵母菌的子囊为圆形大细胞，内有24个圆形的小细胞即为子囊孢子。（六）微生物菌落特征视察1, 已知菌落的视察与识别 细菌与酵母菌菌落的视察与识别 细菌与酵母菌都是单细胞微生物，菌落由菌体积累而成，有共同的特征，较潮湿, 光滑, 透亮, 易挑起，菌落的正反面, 边缘与中心颜色一样，质地较匀称。但两者也有区分，细
36、菌的菌落较小, 较薄, 较透亮, 较潮湿, 颜色多样，较有“细腻”感。有鞭毛的细菌其菌落较扁平, 边缘不规则。有芽孢的细菌菌落粗糙, 多皱, 不透亮。酵母的菌落比细菌的大, 厚，外观较稠, 较不透亮。 放线菌与霉菌菌落的视察与识别 放线菌与霉菌的细胞都呈丝状，在固体培育基上都有基内菌丝即养分菌丝与气生菌丝的分化，因此菌落由菌丝相互缠结而成，外观干燥, 不透亮，呈蛛丝状或绒毛状，菌落与培育基结合紧密不易挑起。菌丝, 孢子常分泌不同色素，故使菌落的正反面, 中心与边缘表现不同的颜色。两者也有区分：放线菌比霉菌菌丝细，生长后期分化的孢子丝有大量的孢子，因而它的菌落比霉菌小而紧密，表面呈干粉状。霉菌的
37、菌丝比放线菌粗长，菌丝生长快而松散，所以菌落大而疏松。依据“菌落形态视察记录表”的项目，细致视察并比较四大类微生物的异同。1, 相识未知菌落 细致视察各编号的未知菌落的各项特征，运用区分各大类微生物的原则，分别归入相应的大类中，并将鉴别的结果填入“微生物菌落形态视察记录表”中。微生物菌落形图3-1 微生物菌落的形态（自赵斌）态参见图3-1。 七, 作业与思索（一）绘图1, 绘出吸水链霉菌“5102”与紫色直丝链霉菌自然生长的个体形态图；2, 绘出吸水链霉菌“5102”与紫色直丝链霉菌的孢子丝与孢子的形态图；3、 绘出根霉, 青霉, 曲霉的个体形态图，并注明各部位名称；4, 绘出酵母菌的子囊,
38、子囊孢子形态图并注明各部位的名称；4、 将各菌落的视察结果记入下表3-1中，并报告各编号菌落的视察, 识别结果。（二）思索题1, 为什么在培育基上放了玻璃纸后，放线菌仍能生长？2, 印片法成败关键在哪里？3, 四大类微生物的菌落形态有何异同？为什么？4, 从微生物菌落形态区分四大类微生物有何意义？表3-1 微生物菌落形态视察记录表大类菌名或编号大小（mm）形成方式表面形态边缘干湿颜色光泽厚度透亮度细菌放线菌酵母菌霉菌未知菌12345试验4培育基制作, 灭菌消毒及无菌操作接种技术一, 试验目的1, 学习细菌, 放线菌及真菌常规培育基的制备方法；2, 学习微生物操作中常用的灭菌与消毒方法；3, 驾
39、驭高压蒸汽灭菌锅的灭菌原理及运用方法；4, 学习并驾驭棉塞制作及常用器皿包扎的方法；5, 学习并驾驭无菌操作技术要点。二, 试验内容1、 牛肉膏蛋白胨培育基的制备；2、 高氏一号合成培育基的制备；3、 马铃薯蔗糖琼脂培育基的制备；4、 棉塞的制作及玻璃器皿的包扎；5、 常用灭菌与消毒方法简介；6、 用高压蒸汽灭菌锅对培育基与器皿进行灭菌；7、 微生物接种技术介绍。三, 试验原理培育基（culture medium）是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种养分物质混合配制而成的养分基质，主要用于微生物的分别, 培育, 鉴定, 菌种保藏或积累代谢产物等方面。其种类许多，依微生物的种
40、类, 养分类型以及探讨目的的不同而异，试验教学常用的有以下三种。牛肉膏蛋白胨培育基是细菌学探讨最常用的自然培育基。在配方中不加琼脂时称之为肉汤培育基。加入琼脂配制的固体培育基一般用于细菌的分别, 培育与测数等。高氏一号培育基是一种合成培育基，常用于分别与培育放线菌。马铃薯蔗糖培育基是一种半合成培育基，常用于分别与培育多种真菌。四, 试验材料1, 药品与试剂：牛肉膏, 蛋白胨, NaC1, 10%NaOH溶液, 10%盐酸溶液；可溶性淀粉, K2HPO4, MgSO47H2O, KNO3, NaCI, FeSO47H2O, 琼脂。2, 材料：簇新马铃薯, 蔗糖或葡萄糖。五, 试验用品小铝锅, 天
41、平, 牛角匙, 1000mL刻度搪瓷杯, 玻棒, pH试纸, 分装漏斗, 衣棉, 橡皮圈, 100 mL烧杯, 标签纸, 电炉, 菜板, 小刀, 纱布, 18mm180mm试管。六, 试验方法（一）牛肉膏蛋白胨培育基的制备1, 培育基配方牛肉膏5.0g, 蛋白胨10.0g, NaC1 5.0g, 琼脂20.0g, 自来水1000 mL, pH7.0。2, 操作步骤 在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g, 蛋白胨10.0g，加50 mL自来水，置电炉搅拌加热至牛肉膏, 蛋白胨完全溶解。 向小铝锅中加入500 mL自来水，将溶解的牛肉膏, 蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗23次。加入5.0gNaC
42、1，在电炉上边加热边搅拌。 加入洗净的琼脂条，接着搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL。 用玻棒沾少许液体，用pH试纸测定pH值。用NaOH或HC1调至pH7.0。 分装漏斗分装于18mm180mm试管中，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好。是否可以搁置几天后进行灭菌？ 高压蒸汽灭菌，121灭菌30min。 分装到试管中的培育基灭菌后趁热摆放斜面。（二）高氏一号合成培育基的制备1、 培育基配方可溶性淀粉20.0g, 硝酸钾1.0g, K2HPO40.5g, MgSO47H2O 0.5g, 氯化钠0.5g, 硫酸亚铁0.01g, 琼脂20g, 蒸馏水1000 mL,
43、 pH7.27.4。2, 操作步骤 用搪瓷杯量取自来水500 mL置小铝锅中，在电炉上加热。 依据培育基配方，依次称取各种药品加入搪瓷杯中，搅拌匀称。其中可溶性淀粉称入100 mL烧杯中，加入50 mL自来水调成糊状，待培育液沸腾时及如铝锅中，边加边搅拌，以防糊底。 加入20g浸洗过的琼脂煮沸至熔化，补足1000 mL水量，调pH7.27.4。 趁热分装于18mm180mm试管，斜面试管每管8 mL，若倒平板则每管装15 mL，装量依据须要而定。 塞好棉塞，装入小铁丝筐，并用旧报纸将棉塞部分包好，贴好标签。 高压蒸汽灭菌，121灭菌30min。 若有斜面试管，在灭菌后刚好摆放斜面。（三）马铃薯
44、蔗糖琼脂培育基的制备1, 培育基成分去皮的马铃薯200g , 蔗糖或葡萄糖20g, 琼脂20g, 自来水1000 mL, pH 自然2, 操作步骤 称取去皮簇新马铃薯200g 切成1cm 见方小块放于小铝锅中，加1000m L 自来水，置电炉上煮沸20min 后，用双层纱布过滤。滤液计量体积后倒入小铝锅中煮沸。 加入称好的蔗糖, 琼脂，加热搅拌至琼脂完全熔化，并补足水量至1000m L。 趁热用分装漏斗分装于18mm180mm试管，斜面以8 m L为宜，柱状15m L为宜。分装完毕后做好棉塞，装入小试管筐并捆好，写好标签。 高压蒸汽灭菌，121灭菌30min。若需摆斜面，灭菌后趁热摆成斜面。（
45、四）棉塞的制作及玻璃器皿的包扎图4-1 棉塞的做法（自赵斌）(a)棉塞的制作过程；(b)正误棉塞棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此棉塞质量的优劣对试验的结果有很大的影响。正确的棉塞要求形态，大小，松紧与试管口或三角瓶口完全适合，过紧则防碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。加塞时，应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内。如图4-1(b)所示。做棉塞的棉花要选纤维较长的，一般不用脱脂棉做棉塞。因为它简洁吸水变湿，造成污染，而且价格也贵。做棉塞过程如图4-1（a）所示。此外,现配现用的培育基与无菌水，还可运用硅胶橡胶塞或聚丙烯塑料试管帽。在微生物试验与科研中，往往要用到通气塞。所谓通气塞就是几层纱布，一般8层，相互重迭而成，或是在两层纱布间匀称铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培育基的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培育，以获得良