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1、附件6:体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则生物芯片类试剂生产及质量控制技术指导原则前 言本指导原则所定义生物芯片诊断试剂是指将多个生物探针(包括DNA片段,寡核苷酸,抗原,抗体,组织,细胞等)按预先设计排列方式固定在特制基质(包括玻璃片,尼龙膜,硝酸纤维素膜等)上,用特定方法提取生物靶分子并进行标记,然后和固定在基质上生物探针特异性结合,再用相应检测设备(如激光扫描仪,CCD检测仪等)和分析方法(包括软件)进行检测,记录,分析,实现对生物靶分子定性或定量检测试剂.根据芯片制作主要原料和方法,生物芯片可分为核酸芯片,蛋白芯片,细胞芯片,组织芯片,芯片实验室等.本指导原则是针对核酸和蛋白为检测
2、靶分子生物芯片生产及质量控制技术指导原则,其它类型靶分子检测芯片诊断试剂可参考本指导原则.由于生物芯片技术还在不断发展,国家食品药品监督管理部门可依据科学技术发展需要,适时组织对本指导原则进行修订.一,基本原则(一)生物芯片诊断试剂生产用物料包括:原料,辅料和包装材料.各种物料应当制定相应质量指标,并应符合有关法规要求.(二)生物芯片诊断试剂生产企业应具备相应专业技术人员,相适应仪器设备和生产环境,获得医疗器械生产许可证;应当按照体外诊断试剂生产实施细则(试行)要求建立相应质量管理体系,形成文件和记录,加以实施并保持有效运行;应当通过体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准(试行)考核.(
3、三)生物芯片诊断试剂研制应当按照科学,规范原则组织研发,各反应条件选择和确定应符合基本科学原理.(四)生物芯片诊断试剂生产过程中所用物料及工艺,应充分考虑可能涉及安全性方面事宜.二,物料质量控制(一)核酸检测芯片核酸芯片检测时,从生物样本中提取核酸可用荧光标记,金标记和酶标记.检测方法包括光谱学方法和化学显色.下面为荧光标记芯片技术指导原则,采用金标记和酶联显色等生物芯片诊断试剂可参照核酸芯片和蛋白芯片相关部分.1,主要生物原料核酸检测芯片主要生物原料包括模板DNA,dNTPs,引物,探针,标记物等.应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验,以保证其达到规定质量标准.主要生物原料供应商要求相对
4、固定,不得随意变更供应商.(1)模板DNA重组DNA:经测序验证,关键位置没有错误.1TE溶解,浓度为1g/l以上,-20保存.(2)dNTPs(dATP/dUTP/dGTP/dCTP/dTTP)HPLC纯,PCR级,无DNase,RNase污染.-20以下保存.外购者,由生产厂家提供质量保证证明,达到生产要求.(3)引物序列确证;进行PCR扩增后,克隆测序鉴定验证,建立引物标准品.生产中引物原材料为冻干粉,PAGE纯或HPLC纯,外购者,供应商应提供该产品质检证明,如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱;自己合成引物,需有PAGE电泳结果或HPLC分析图谱.用标准DNA模板扩增,电泳检测,谱带
5、单一,大小正确,和对照引物比较,产物量一致.符合视为合格引物.-20以下保存.(4)探针(用于阵列制备)重组DNA, 冻干粉(或1TE溶解液):每种90g以上,酶切鉴定分析图谱.PCR产物,冻干粉(或1TE溶解液):每种90g以上,PCR电泳鉴定图谱.合成寡核苷酸:PAGE纯或HPLC纯,每种90g以上,提供该产品PAGE电泳分析图谱或HPLC分析图谱.外购者,供应商应提供质量保证证明,达到生产要求.探针序列正确性:应用克隆鉴定标准DNA杂交鉴定或进行测序鉴定.外购者,供应商应提供质量保证证明,达到生产要求.纯度和浓度检测:用电泳方法,电泳图谱没有杂带,目标条带强度和已知浓度标准DNA条带进行
6、参比计算其强度.纯度较高DNA,可用紫外分光光度计进行定量.检定合格后入库.避光,-20以下保存.(5)标记物含有激发光波长和发射光波长介于280680nm所有荧光分子,HPLC纯,供应商应提供质量保证证明.(6)Taq DNA聚合酶SDS-PAGE 检测,纯度95%,具DNA聚合酶活性,无核酸外切酶活性及核酸内切酶活性,具热稳定性,941小时后仍保持50%活性,由供应商提供质量保证.-20保存.(7)UNG(尿嘧啶糖基化酶)具尿嘧啶糖基化酶活性,无核酸外切酶及核酸内切酶活性.1U UNG 37处理3分钟后,103拷贝以下含U模板被降解后,不能产生扩增产物,供应商提供质量保证.-20保存.(8
7、)RT 酶具有逆转录活性,供应商提供质量保证.-20保存.(9)RT-PCR酶具逆转录酶活性和DNA聚合酶活性,无核酸外切酶活性及核酸内切酶活性,具热稳定性,941小时后仍保持50%活性.-20保存.(10)缓冲液各类酶制品需要反应缓冲液由厂家随酶制品提供,供应商提供质量保证.-20保存.2,主要生物辅料(1)杂交液购买成品者,供应商提供质量标准,并按要求保存.自制杂交液,按半成品检定标准要求进行检定.(2)酶类蛋白酶,核酸酶等,供应商提供质量标准,并按要求保存.(3)核酸提取试剂供应商提供质量保证,并按要求保存.如果是自制提取液,按半成品检定要求.(4)鱼精DNA供应商提供质量保证,并按要求
8、保存.(5)封闭用蛋白包括牛血清白蛋白,奶粉等,提供质量标准,并按要求保存.3,主要化学原辅料参照中国生物制品主要原辅材料质控标准(2000年版)分析纯级别进行检验.主要检测指标包括:溶液外观,一般盐类检测,溶液pH值检测,溶解情况检测,干燥失重检测,炽灼残渣等.主要化学原材料供应商要求相对固定,不得随意发生变更.化学原材料在购入时,原材料生产商必须提供该批次化学原材料质量质量保证材料和质量检验报告,其质量标准应达到生产所需质量标准.(1)无机类主要包括氯化钠,氢氧化钠,纯化水等.(2)有机类主要包括有丙酮,乙醇,枸橼酸,吐温20,乙二胺四乙酸二钠,氨基吡啉等.(3)特殊化学原料聚乙二醇,多聚
9、赖氨酸,丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,N,N,N,N-四甲基二乙胺(TEMED),溴化乙锭(EB),染色剂等.4,其他物料(1)载玻片外观:明亮处用肉眼观察无缺刻,无划伤等.规格按设计要求.激光扫描仪扫描(波长为芯片检测波长):包被层基本均匀.(2)试管,吸头,试剂瓶等一次性使用,由生产厂家提供质量保证,达到设计要求.(3)其他:说明书,包装外盒等参照国家食品药品监督管理局颁布体外诊断试剂说明书编写指导原则和医疗器械说明书,标签和包装标识管理规定执行.(二)蛋白检测芯片1,主要生物原料和生产产品质量最密切相关生物原料包括各种活性抗原,重组抗原,单克隆杭体,多克隆抗体以及多肽类生物原科.这类原料可用
10、于点膜,标记相关酶,纳米金,光学基团及中和反应用抗原或抗体等.使用前应按工艺要求对这类生物原料进行质量检验,以保证其达到规定质量要求.主要生物原料若为企业自己生产,其工艺必须相对稳定;若购买,其供应商要求相对固定,不能随意变更供应商,如果主要原料(包括工艺)或其供应商有变更,必须进行原料验证,并进行补充申报.主要生物原料常规检验项目一般包括:(1)外观肉眼观察,大部分生物原料为澄清透明液体,不含异物,浑浊或摇不散沉淀;或者为白色粉末,不含有其他颜色杂质;特殊生物原料应具备相应外观标准.(2)纯度和分子量主要通过SDS-PAGE电泳和电泳结果扫描仪进行检测,也可用其他适宜方法,如高效液相法等.作
11、为免疫诊断试剂用生物原材料,用银染法染色后,纯度一般都要大于90%;用考玛氏亮蓝染色后;纯度一般都要大于95%.SDS凝胶电泳法测定分子量.(3)蛋白浓度蛋白浓度可通过Lowry法,280nm光吸收法,双缩脲方法等进行检测;(4)效价效价测定一般根据蛋白含量测定结果通过倍比稀释法进行.效价应达到设计规定要求.(5)功能性实验功能性实验是指生物原料用于试剂盒试剂实际生产中情况,一般考查该原料使用后试剂灵敏度,特异性和稳定性.2,主要生物辅料生物辅料指是在生产过程中作为蛋白保护剂用途一类生物原料,主要包括小牛血清,山羊血清,牛血清白蛋白和酪蛋白等.这些生物原料均应按照中国生物制品主要原辅材料质控标
12、准(2000年版)所规定质量标准要求进行检验,达到相应质量标准后方应用于生产.生物辅料供应商同样要求相对固定,不得随意变更供应商.对于小牛血清或山羊血清,牛血清白蛋白以及酪蛋白等,还应进行功能性实验,即以其为原料配制10%浓度稀释液作为样品,进行酶联免疫测定,均不得出现非特异性反应.对于标记用酶,应在产品质量标准中明示所使用标记用酶名称(如辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶等),同时应根据不同生产厂家检定方法和质量标准进行检验,酶纯度RZ值(OD403nm/OD280nm)应大于3.0.3,化学原辅料参照中国生物制品主要原辅材料质控标准(2000年版)分析纯级别进行检验.主要检测指标包括:溶液外观,一
13、般盐类检测,溶液pH值检测,溶解情况检测,干燥失重检测,炽灼残渣等.主要化学原材料供应商要求相对固定,不得随意发生变更.化学原材料在购入时,原材料生产商必须提供该批次化学原材料质量质量保证材料和质量检验报告,其质量标准应达到生产所需质量标准.(1)无机类主要包括氯化钠,氢氧化钠,纯化水等.(2)有机类主要包括有丙酮,乙醇,枸橼酸,吐温20,乙二胺四乙酸二钠,氨基吡啉等.(3)特殊化学原料DAB(联苯二胺),染色剂等.4,其他物料(1)基质以硝酸纤维素膜为例:孔径符合设计要求(0.45m,0.22m等),均一性(厚度及毛细迁移速度20%),尺寸(和标识吻合)(2)瓶子和干燥剂由生产厂家提供质量保
14、证,达到规定要求.(3)其他:说明书,包装外盒等应参照国家食品药品监督管理局颁布体外诊断试剂说明书编写指导原则和医疗器械说明书,标签和包装标识管理规定执行.三,试剂盒各组分生产生物芯片主要包括DNA芯片,蛋白芯片,组织芯片,细胞芯片以及芯片实验室等.生物芯片诊断试剂产品基本可分成二个部分,一部分是芯片,另一部分检测用工作液.如果有配套检测仪器,还需对仪器及处理软件应用加以说明.(一)芯片生产芯片生产基本过程包括探针获取方法,纯化,点样,固定.1,探针获取不同芯片,主要是探针不同,生物芯片探针主要包括以下几类,其它探针可参考制定相应技术及质量标准.(1)DNA探针获取探针形式有PCR产物,克隆D
15、NA,人工合成DNA片段等;要求有生产程序和质量指标及检测方法,要进行纯化,有固定纯化程序.(2)抗原生产抗原获得方法包括细胞培养,从生物材料中分离提取,基因工程表达以及合成肽等.基因工程表达产物又分为纯抗原蛋白,融合蛋白等.(3)抗体抗体分单克隆抗体和多克隆抗体.抗体制备包括细胞培养,动物腹水,基因工程表达等方式.(4)细胞和组织包括细胞或组织类型,固定方法.组织材料还包括固定,包埋,切片等.(5)芯片实验室,包括各种管道泵制作等.2,阵列排列设计阵列排列包括依次排列,随机排列,对角线排列等,设计时需考虑重复次数等.3,点阵制作使用仪器要确定型号,程序;手工制作也要有标准操作程序.4,固定:
16、包括固定方式,固定条件等.应对芯片生产过程进行相应质量控制,如点样和固定过程监控,点样均一性检验等.(二)工作液配制1,芯片生产所需试剂,包括细胞培养基,探针制备试剂,阵列制作和固定试剂等.2,样品处理试剂,芯片检测靶分子分为核酸和蛋白质.检测核酸样品处理试剂包括临床取样,DNA提取或RNA提取试剂,逆转录试剂,PCR扩增试剂,核酸标记试剂等;检测蛋白处理试剂包括取样试剂,蛋白稀释液以及特殊试剂等.3,反应液:检测核酸时反应液包括预杂交液,杂交液,洗脱液等;检测蛋白时,包括封闭液,抗原/抗体反应液,洗脱液,显色液,显色终止液等.(三)数据判读1,判断标准及依据,包括Cut off值确定依据.
17、2,数据判读方式:人工还是软件判读.3,如果是软件判读,应提供软件判断科学依据(包括生物学原理,数据获取原理和判断实验是否成立依据)以及实验测试原始报告(或数据),并需要说明:(1)软件来源:购买或自己编制,是否获得注册等.(2)软件用途:包括对数据分析,存储,解读,含义等.(3)软件使用:基本使用程序.四,半成品质量控制(一)抽样检验人员按批号抽取检定需要数量半成品,作好标记,待检.(二)质控品 可用克隆并测序鉴定DNA或经特异性鉴定抗原(或抗体).质控品基质应尽可能和被测物基质相一致.(三)检定要求1,芯片检定(1)灵敏度:最低检测限达到规定要求.(2)特异性:应达到规定要求.若进行全阴,
18、全阳和交叉反应检测,全阴性检测应在没有靶分子存在时,所有检测位点没有检测信号;全阳性检测应在加入足够量靶分子,所有检测位点均有检测信号;交叉反应检测时,用某一位点靶分子检测,应只有该位点有检测信号,其它位点不能有检测信号.(3)精密性(均一性):用比最低检测限高一个数量级质控品,重复检测10次,判定结果一致.考虑到芯片多位点检测,因此要进行全位点和单个位点进行检测.半成品检定可以用克隆DNA和鉴定抗原和抗体作质控品.2,工作液检定(1)物理检测:外观颜色正常,没有杂质.(2)质量检定:用被检定工作液检测标准样,检测结果达到预定要求.五,成品质量控制(一)生产批量申报生产批量每批原则上不低于1000人份.(二)抽样检验人员按批号抽取检定需要数量半成品,做好标记,待检.(三)标准品(参考品)应用国家标准品或参考品进行检定,若无国家标准品(参考品),可以使用企业参考品,但其标准不得低于第一家已经获得批准该类试剂.(四)检定要求1,灵敏度:应达到规定要求.2,特异性:应达到规定要求.3,精密性(均一性):对某一样本,重复10次,对病种定性检测结果一致.4,稳定性(仅对蛋白芯片)37放置至少3天,灵敏度,特异性和精密度仍达到规定要求.热加速破坏试验时间长短,可由生产单位根据不同产品在37贮存和常温贮存(28)中质量变化相关性来决定