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1、胶体金标记探针的制备方法及其应用芦光新( 青海大学农牧学院, 青海 西宁810003)摘要 : 介绍了胶体金标记技术, 并就其在细胞和分子生物学研究方面的应用做了简单概述。关键词 : 胶体金 ; 胶体金标记技术 ; 分子生物学中图分类号 : Q819文献标识码 :A文章编号 :1006- 8996(2004)03- 0043- 04Preparing and application of the colloidal gold-labeled probeLU Guang2xin(Agriculture andAnimal HusbandryCollegeof QinghaiUniversity,
2、 Xining 810003,China)Abstract:The colloidal gold- labeledmethodwas introduced,and its applicationwassummariz ed in cellandmolecularbiology.Key words: colloidal gold; colloidal gold- labeledmethod;molecularbiology早在 1962年,Feblorr 等首次介绍了胶体金可作为一种电镜示踪的标志。Faulk 和 Taylor 1在 1971 年第一次将胶体金颗粒作为一种特异的标记物用于电镜研究
3、中。由于胶体金标记技术本身的优点,在免疫细胞化学方面受到了重视和广泛应用, 并逐步向微生物学、 医学、病毒学等领域渗透。随着分子生物学的迅速发展 , 胶体金标记技术也逐步发展成为研究基因功能的重要手段。本文就胶体金标记技术及其应用作一简单概括。1原理及优点金氯酸分子 (HAuCl4) 在还原剂的作用下聚合形成金颗粒, 由于颗粒间相互排斥的静电作用和布朗运动, 使整个系统保持在一个相对稳定的水溶胶状态, 即胶体金 ( colloidalgold)。由于胶体金颗粒具有高电子密度 , 易与生物大分子(DNA、 RNA、 糖蛋白等 ) 结合 , 将其标记到抗体或SPA(staphylococcuspr
4、otein A)上,再利用抗原抗体的血清学反应原理, 把金颗粒连接到抗原上, 在电子显微镜下会有致密的电子层, 即可进行抗原的定性定位和诊断鉴定。这种方法与同位素标记法、荧光素标记法、 酶标法、生物素标记法相比较 , 具有制作方便、 价格低廉、容易操作、无放射性污染等优点。而且胶体金与生物大分子结合不会影响其生物活性 , 使用时不受组织、 细胞中内源性酶的影响, 结果可以长期保存。2胶体金的制备方法还原法是胶体金制备最常用的方法, 即在金氯酸水溶液中加入各种还原剂, 如白磷、柠檬酸、鞣酸、H2O2等, 使金氯酸聚合形成金颗粒。最常用的方法有: 1 柠檬酸三纳法。将0101% 金氯酸 ( HAu
5、Cl4) 水溶液 100 mL 加热至沸腾 , 迅速加入 4 mL 1%柠檬酸三钠水溶液, 约 5 min 后出现橙红色, 该溶液中含有胶体金颗粒。胶体金颗粒大小依柠檬酸三钠的用量减少而增加, 用量减至115 mL、 110 mL 和 0175 mL,则金颗粒直径分别增至30 nm、 50 nm 和 70 nm2, 3。 o 鞣酸 ) 柠檬酸钠法。将1 mL 1%金氯酸水溶液加入 79 mL 双蒸水中混匀为A 液, 另将 4 mL 1%柠檬酸钠 , 4 mL1% 鞣酸 , 012 mL 011 M K2CO3溶液混合加双蒸水至 20 mL 为 B 液。二者同时加热到60 e ,磁性搅拌下将B
6、液迅速加入 A 液 ,继续加热搅拌至溶收稿日期 : 2003- 09- 15作者简介 : 芦光新 ( 1974) ) , 男, 青海大通人, 讲师 , 硕士 。第 22 卷第 3 期2004年 6 月青海大学学报 ( 自然科学版 )Journalof QinghaiUniversityVol122 No13Jun 12004名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 4 页 - - - - - - - - - 液呈亮红色 , 所得金颗粒为3 nm,如改变 1% 鞣酸用
7、量 ,从 4 mL减至 011 mL, 则金颗粒直径从3 nm 增至15 nm。此外 , 还有抗坏血酸还原法、 乙醇超声法、 维生素 C 钠盐还原法、 白磷法、硼氢化钠还原法、 放射性法等胶体金的制备方法 4。3胶体金探针的制备胶体金 ) 蛋白复合物又称胶体金探针, 其制备过程就是胶体金和标记物的结合与纯化的过程, 在探针制备之前 , 首先用 50 mmol PL NaO H 调胶体金 pH 使其接近与它结合的蛋白质的等电点或略偏碱的数值,这样有利于胶体金和标记物结合更稳定 5。探针制备过程如下:3. 1标记蛋白质的准备在免疫细胞化学中, 高纯度蛋白是探针标记特异性的关键,但有些蛋白产率很低,
8、 其商品化产品纯度不是很高 , 其中的电解质会引起胶体金的聚集和沉淀, 因此将蛋白质透析三次, 才能达到较高的纯度 5。如果有些蛋白分子质量很低(小于 40KD), 等电点太低或太高(PI 小于 515 或大于 915) 难以制备出稳定的复合体或失去原有的标记活性, 这时首先需要有其他蛋白( 如 BSA)交联形成较大分子, 然后制备探针 , 以杜绝意想不到的非特异性标记 6。在胶体金探针制备过程中, 蛋白质与胶体金颗粒之间应按一定的比例结合, 蛋白质过高使游离蛋白的量增加 , 而蛋白质的量不足, 极易形成聚集物而沉淀。因此, 在制备胶体金) 蛋白复合物时需确定使一定量的胶体金得以稳定的最小蛋白
9、的量。一般采用目测法确定蛋白的需要量, 方法如下 : 在 9 支小试管中分别加入011 mL 蛋白液 ,浓度成倍递减 , 分别为 011 mg、 0105 mg、 01025 mg, , , 然后每支试管里加入 015 mL 胶体金 , 室温下静置15 min, 每管加入011 mL 10% NaCl, 此时发现 , 在蛋白质低于某一浓度后,由于 NaCl的电解质液的作用, 管中的胶体金会产生聚集并沉淀而变蓝。假如第五管开始变蓝, 那么应取第四管的蛋白的量(010125 mg)为稳定该胶体金所必须的最低蛋白的量。3. 2胶体金 -蛋白复合物的制备确定蛋白的用量后,在胶体金溶液中加入适量蛋白液,
10、 10 min 后再加入10 LL 2% 聚乙二醇 ( PEG20000), 其最终浓度为0105% ,混匀后 8000 rP min 离心 30 min, 吸取上清液 , 用 200 LL BL 悬浮 , 即可获得胶体金探针 , 也可加甘油混匀, 置- 20e 保存备用。4胶体金标记技术的应用4. 1组织细胞定位方面的研究通过金颗粒与抗原蛋白的间接结合, 借助于电子显微镜, 可观察到抗原蛋白在组织细胞中的位置, 从而达到定位的目的。丁明孝等 7通过大量的标记实验, 建立了过氧化氢酶、 5- 核苷酸酶、Mg2+- ATP 酶、 Na+- ATP 酶、 K+- ATP 酶、 Ca2+- ATP
11、酶等 16 种细胞和细胞器标志酶的体系 , 这对于受体位点方面的研究, 如在膜蛋白受体, 激发子 -受体位点、毒素方面具有很高的价值。另外 , 应用胶体金标记技术可以确认细胞器, 对于某些亚细胞组分的确认,在一些细胞内发现特殊的细胞器样构造 , 为了确定构造的类型 , 可以用某些细胞器特有的酶的抗体与胶体金结合来标记确认 8。4. 2某些物质在机体代谢中转运方式的研究Kataka和 Tavassoli(转引自王龙生等 , 1990) 9曾将球蛋白) 胶体金复合物由动物门静脉注入,然后取肝作超薄切片 , 证明转铜蛋白及转铁蛋白都是经血窦内皮细胞吞噬而转运的, 且转运与温度有关。张蜀秋等10用胶体
12、金技术对植物根中ABA 超微结构水平的分布及其与运输的关系进行了讨论, 为 ABA有可能作为由根向上部分传递的逆境信息提供了进一步的证据。曹文波等 11对蚕豆叶片细胞中IAA也用该法进行了研究,得到了满意的结果。4. 3在病理学方面的研究在疾病或病害诊断方面, 胶体金标记技术应用比较多。近年来的研究表明, 直径在 15 nm 以上的胶体金是由肉眼水平检测免疫反应的理想的标记物,可以和酶、同位素一样用于抗原、抗体的检测和特异44青海大学学报第 22卷名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - -
13、- - 第 2 页，共 4 页 - - - - - - - - - 性鉴定。应用胶体金可以检测出抗体的特异性和灵敏度, 筛选出第一抗体、 第二抗体的最佳稀释浓度,使阳性染色相对较强,背景染色最低。胶体金标记技术在医学上应用较早, 目前在透射电镜下已成功的标记了病毒、细菌、 红细胞、骨髓细胞、 淋巴细胞、血小板、肾细胞、神经元、垂体组织、 十二指肠等的抗原和生物分子, 为病原检测和疾病诊断提供了一种简洁、 方便、快速的检测手段。胶体金技术在动物医学方面的应用也很广泛12。林文玉等 13将该技术用于包虫病的检测, 用胶体金标记二抗进行包虫病的血清诊断, 提高了工作效率 , 保证了较高的成功率。胶体
14、金标记技术在植物病理学方面的应用较广。对于植物病害的检测, 通过金颗粒与抗原蛋白的特异结合 , 在电镜下可以通过金颗粒直观的表现出来, 这样利用某种病原的特异抗血清就可将该种病原很快检测出来 14。胡东维等 15 对郁金香杂色综合症病原进行了免疫电镜鉴定和检测。徐颖等16在植物病毒标记胶体金探针的制备方面做了大量的研究。目前, 应用胶体金技术, 快速检测烟草花叶病毒(TMV) 、 黄瓜花叶病毒 (CMV) 、 马铃薯 X 病毒 ( PV Y) 、 烟草脆裂病毒( TRV) 、 大豆花叶病毒( SM V) 均获得成功 17。在植物病毒研究中, 单克隆抗体的筛选和抗原决定簇定位,利用单克隆抗体可以
15、识别存在于抗原表面的 , 不同于其它病毒或株系的单一抗原决定簇的特性, 将胶体金与单克隆结合, 可以确定某一种抗原决定簇在抗原表面的位置。1988年, CottfriedHinmler 将胶体金标记的羊抗鼠抗体IgG+ IgM 用于李痘病毒 ( Plum POX Virus, PPV) 单克隆抗体 (McAb) 的早期筛选 , 确定出不同McAb 的抗原决定簇的位置;同样 ,Dorel 也用金标记的羊抗鼠抗体作探针确定了TMV 表面不同抗原决定簇的位置( 转引自相宁等,1991) 17。在木 霉 (Trichoderma)真菌 对多 种植 物 真菌 病 害是 否有 较 好的 生 物防 治 效果
16、 的 问题上 10, 18, 为了研究植物病原菌、 生防菌及植物三者之间的机理, 徐颖等 19采用免疫胶体金双标记技术,制备了凝集素和纤维素酶胶体金探针, 完成了一步标记法,并系统地分析了木霉和疫霉内在的相互关系,揭示了木霉作为一种生防菌, 对疫霉菌具有强烈的抑制作用的机理。4. 4分子生物学方面的应用电镜原位杂交技术的兴起, 为核酸大分子在细胞中的精确定位提供了有效的实验手段, 在核酸的检测和定位上有广阔的应用前景。1986年, Binder等 20介绍了将胶体金标记技术同原位杂交技术结合起来的方法 , 随着这一技术的不断完善和改进, 国外学者成功地将其应用到基因定位、基因表达、基因进化以及
17、细胞分类和杂交细胞的遗传分析等领域2125。国内宋林生等26用几种 RNA 的 cDNA 作为探针 , 采用电镜原位杂交技术,对染色体中几种RNA 进行定位 , 证实了 rRNA、 tRNA 在染色体中的存在及分布特点,对研究染色体结构以及RNA 与染色体的关系提供了一定的理论意义。近年来 , 我们的研究工作在多种动植物病菌、真菌几丁质、 真菌的附着胞形成蛋白、植物多糖、植物病原激发子、植物防卫反应基因及激发子受体等的免疫细胞化学和核酸原位杂交方面有了一定的积累,制备了包括 LgG、 ProteinA、 WGA、 ConA、 UEAI、 DBA、 avidin、 streptavidin 、
18、elicitin、 cellulase 、 Dnase 、 Rnase 、 Chiti2nase等在内的多种胶体金探针, 取得了满意的标记效果。在基因功能及基因表达方面, 我们采用分子细胞学的方法 , 以禾谷类作物与白粉病菌互作模式为研究对象, 制备了胶体金探针, 先后对 MLO 蛋白进行了细胞定位 , 研究了 mlo 基因的表达与积累, 揭示了 mlo 基因诱发的抗白粉病菌的广谱抗病机制(待发表)。另外 , 检测了禾谷类作物与白粉病菌互作中B - 1, 3- 葡聚糖酶底物的分布,为转 B-1, 3- 葡聚糖酶基因与植物抗病性研究提供了一点理论依据 27 。5结语目前 , 胶体金标记技术已深入
19、到了基因转录水平、基因表达的检测、 染色体的基因定位、 特定核酸序列在细胞内的空间分布分析及核酸复制过程中的定性定量分析等。随着基因功能组学的兴起, 在用胶体金标记技术进行基因的表达和基因功能的评价方面具有诱人的前景。45第 3 期芦光新 : 胶体金标记探针的制备方法及其应用名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 4 页 - - - - - - - - - 参考文献 : 1Faulk W P, Taylor G M. An Immunocolloid me tho
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