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1、收稿日期 : 2000-03-06; 修订日期 : 2000- 06-24基金项目 : 天津市重大科技攻关项目( 993121311)作者简介 : 杨依军 ( 1962) ,男, 吉林市人 , 副研究员 , 博士 , 主要从事分子植物病理学研究.拮抗木霉菌在生物防治中的作用杨依军1, 王勇1, 杨秀荣1, 齐中波2, 程根武3( 1 天津市植物保护研究所, 天津 300112; 2 天津市科学技术委员会, 天津 300042;3 沈阳农业大学植保系)摘要 : 简述了拮抗木霉菌的抑菌作用机理、生防工程菌株的构建、生防制剂的研究及其应用现状。展望了拮抗木霉菌在生物防治上的应用前景。关键词 : 木霉
2、菌 ; 生物防治 ; 拮抗作用中图分类号 :S476+. 8文献标识码:A文章编号 : 1006-6500( 2000) 03-0029-05木霉属 ( Trichodermaspp.) 真菌归于半知菌亚门、 丝孢纲、丝孢目 , 粘孢菌类。 它是自然界中普遍存在的一类真菌,常见于植物残体及动物粪便上, 从植物根围及种子、 球茎表面经常可以分离到。木霉属菌具有重要的经济意义,某些木霉种具有很强的水解活性, 如里氏木霉 ( T .reeaei) 可用于生产纤维素酶和动物糖蛋白。此外 , 少数木霉种群被认为是植物根围的微效病原菌, 这些木霉能引起蘑菇病害。在木霉菌的种群中有一大类被称为拮抗木霉, 它
3、们对许多植物病原菌具有寄生或拮抗作用,如哈茨木霉(T.harzinum) 、 绿色木霉 (T.viride) 、 钩状木霉 (T.hamatum)、 长枝木霉 (T.longibrachiatum ) 、 康 氏木霉 (T . koningii ) 以及新 近归为 粘帚 霉属的 绿粘帚 霉( Gliocladiumvir ens = T richoderma vir ens ), 但目前农业生防上商业化的产品主要是哈茨木霉菌株及少量的绿色木霉菌株 9。本文仅就拮抗木霉的胞外酶类、次生代谢产物、 基因工程菌株的构建、生防制剂的研究与应用等方面简述如下:1拮抗木霉菌的胞外酶1. 1种类拮抗木霉菌与
4、生防作用有关的胞外酶主要是几丁质酶类和-1, 3-葡聚糖酶。其中几丁质酶类中两种为外几丁质酶:N-乙酰- -D-氨基葡聚糖苷酶(N-acety1glucosamindase)和几丁二糖酶 ( Chitobiosidase) , 另一种为内几丁质酶。经测定, 几丁二糖酶的分子量为40 Kda, 内几丁质酶的分子量为41 Kda。已有研究表明上述酶类对植物病原真菌的胞壁具强烈的水解作用,从而抑制病原菌孢子萌发并引起菌丝和孢子崩解, 而且它们之间具有协同作用, 同时也具有与杀菌剂及细菌等生防因子协同作用的功效。Lorito等人用从哈茨木霉P1 菌株中提纯的内几丁质酶和几丁二糖酶测定对9 种植物病原菌
5、的活性, 发现对大多数病原真菌上述两种几丁质酶2000 年 9 月Sep. 2000天津农业科学T ianjinA g ricultural Sciences第 6 卷第3 期V ol. 6 N o. 3名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 5 页 - - - - - - - - - 的 ED50分别为35135g/mL; 而哈茨木霉P1菌株本身对上述几丁质酶具有高度的抗性ED50 1 000g/ mL 。这主要是由于酶作用病原菌细胞壁及原生质膜, 有助于抗生素
6、扩散到作用位点上 10, 11。也有研究证明: 哈茨木霉在植物病原菌诱导下可以分泌丝氨酸组蛋白酶, 这种蛋白酶与枯草溶菌素 (Subtilysins) 一族的丝氨酸蛋白具有一定同源性 6。1. 2生防因子酶类的产生特性上述已报道的木霉菌产生的胞外酶类与它的培养基碳源有关, 当培养基中的壳多糖、 昆布糖、 纤维二糖、羧甲基纤维素和富含纤维素的物质分别或组合为基础碳源时有利酶的产生。在基础培养条件下加入尖孢镰刀菌( Fusarium oxysporum) 、 立枯丝核菌 (Rhiz octonia solani) 或罗氏白绢小菌核菌的菌丝细胞壁时, 可提高酶的产生水平 12。2拮抗木霉菌产生的抗生
7、物质拮抗木霉菌可以产生抗生物质, 它是由木霉菌次生代谢生成的。将康氏木霉、 钩状木霉、哈茨木霉液体培养后研究它的次生代谢产物共有8 种。Ghisaberti 测定哈茨木霉73 菌株的液体培养代谢产物 , 其中生物合成相关的代谢产物均对小麦全蚀病( Gaeumnnomycesgraminisvar.triticiGgt. ) 有拮抗作用。 木 霉 菌 产 生 的 挥 发 和 非 挥 发 性 的 物 质, 主 要 有: 木 霉 素 ( trichodermin)、 胶 毒 素( gliotoxin)、 绿木霉素 (viridin) 、 胶绿木霉素 ( glioviridin)、 抗菌肽 ( pep
8、tide antibiotic) 等。 Lynch研究表明 ,哈茨木霉防治立枯丝核菌的主要机制之一是产生一种挥发性的抗生素,具有椰子香味, 经鉴定为六戊烷基吡喃酮。从长枝木霉和绿色木霉中分离提纯了一组特殊的抗菌肽。分别为 Trichbr achin 和 Trchoirin,并测出了氨基酸序列 7。某些抗生素在一定条件下可转化为不具抗菌活性的化合物。如胶霉毒素 , 在酶的作用下或在代谢进程中可转化为二甲基胶霉素而丧失抗菌活性。绿木霉素的性质也极不稳定,它可转化为还原产物Vir idiol, 这是一种具有极小抗菌活性的物质,不过它具有强烈的除草作用, 同时对农作物也具有毒害作用。3用于生物防治的拮
9、抗木霉菌工程菌株的构建近几年的研究发现,木霉菌作为主要基因的表达分泌系统, 正普遍受到关注, 这不仅因为木霉具有比较成熟的发酵培养技术, 更因为木霉菌具有很强烈的蛋白质胞外分泌能力, 这为构建木霉工程菌株提供了良好的基础。长期以来研究人员一直关注着与真菌寄生相关的酶类如外源几丁质酶、 内源几丁质酶和其它水解酶类在木霉菌防治病害中的作用。 Hara 等将野生哈茨木霉生防菌株进行改造, 将 Serratia marcescent的几丁质酶基因的质粒 pSL3 chi及带有amds 标记的质粒p3SR2 转化到哈茨木霉, 得到的两个转化子在合成培养基上表现增强子的几丁质酶特性, 并检测到Seerat
10、ia mar cescent几丁质酶的存在。 体外拮抗试验表明 ,转化子对罗氏小核菌(Sclerotirum rolf sii) 的抑菌圈大于野生菌株 8。有人曾报道当插入内生几丁质酶基因ech42 后, 重组技术改造的转基因Trichoderma工程 菌株 室 内测 定 可较 野 生菌 株 减少 发 病 9% 19% , 室 内 测定 插 入 失活 几 丁 质酶 基 因?30? 天津农业科学第6 卷名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 5 页 - - - -
11、- - - - - Tr ichoderm a 工程菌株丧失其拮抗真菌的能力, 更有报道 ,携带多拷贝菌寄生相关基因p rbl 的Tr ichoderm a 菌株较野生菌株控制立枯病的发病率减少4/ 5 13。4拮抗木霉菌的制剂研究与应用 应 用于 生 物防 治 的木 霉 菌, 主 要 有: 哈茨 木霉、绿 色 木霉、康 氏 木 霉、木素 木 霉 ( T .lignorum )、 钩木霉、长枝木霉、多孢木霉 (T . polysporum ) 及绿粘帚霉。目前生产上常用的木霉菌剂多为它的孢子制剂,是一种利用孢子与营养基质及固体基质填充混合固定而支撑的颗粒状制剂。适合孢子生长的培养基有PDA 培
12、养基和Weindling 培养基 , 还可利用成本较低的糖浆、 酵母膏和其它农用废料进行液体发酵。用于生产孢子制剂的营养基质有藻酸盐、麸皮、 角叉藻聚糖、脱乙酰壳多糖等, 固体基质填充剂有泥炭藓、踬石页岩、褐藻、叶蜡石等 , 营养基质给孢子生长提供充足养分, 固体基质填充剂可提供合适的碳、氮和其它化学成分。 国内近日报道, 利用城市垃圾发酵生产绿色木霉菌孢子, 这种合成培养基发酵绿色木霉T 1124 菌株 8 天后 , 孢子的产量可达到109/g 以上 1。以色列的M akhteshim Agan 公司开发的以哈茨木霉为T 39 菌株为发酵液的生防制剂, 商品名 Tr ichodex ,剂型为
13、25%可湿粉 , 它可以用于防治灰霉病、菌核病、叶霉病、霜霉病和白粉病等叶部病害 2, 14, 见表 1。表 1T richo dex 对蔬菜作物病害的防治病害及病原菌黄瓜番茄莴苣葡萄灰霉病 ( Botrytis cinerea)+白霉病 ( Scler atina sclerotioru m)+叶霉病 ( Clad osporium f ulv um)+霜霉病 ( Pseudoperonaspora cubensis )+白粉病 ( Sphaerotheca f uliginea )+利用拮抗木霉菌孢子开发出适用于种子及土壤处理孢子制剂。如含有木霉菌的RootPro.土壤处理剂与苗床土按1
14、100 比例均匀搅拌然后播种, 可以有效地防治由终极腐霉菌( Pythiumultimum ) 、 立枯丝核菌、 菌核病菌、罗氏白绢小菌核菌、 尖孢镰刀菌及萝卜苗枯交链孢霉菌 (Alternariaraphni )等土传植物病原菌引起的苗期病害 2。5我国对拮抗木霉菌的研究与应用近几年来 , 国内的科研人员也把生物防治的注意力转移到拮抗木霉菌上来, 并使其逐步在田间得到广泛的应用。马平等 3研究发现 , 木霉菌对棉铃疫病菌的营养生长具有一定的抑制作用, 显微镜下可观察到拮抗木霉菌丝可以大量地缠绕在病原菌菌丝上。又有研究表明, 康氏木霉在培养过程中可以分泌大量的抑菌物质, 生物测定证明 : 康氏
15、木霉所产生的抑菌物质可以有效地 抑制棉 花立枯 病菌 ( Rhizoctonia solani), 苹果 腐烂病 菌 ( Valsa mali ) 和核桃 枝枯病 菌( M elanconis j uglandis ) 4。 拮抗木霉菌防治土传病害的效果已在很多应用试验中得到证实, 将拮抗木霉固体发酵后拌成土壤添加剂, 防治豇豆立枯病和枯萎病, 防治效果可以达到80%以上; 利用木霉菌T5菌株的培养物(悬浮液孢子含量为21065106个/ mL) 防治草莓灰霉?31?第 3 期杨依军等: 拮抗木霉菌在生物防治中的作用名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - -
16、- - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 5 页 - - - - - - - - - 病, 防治效果可与常用的化学农药多菌灵相媲美, 其防效均在80%以上 5, 而且利用这种生防制剂无残毒、 无污染 , 使用安全 , 在草莓等鲜食果品生产中具有较大的推广应用价值。我们研究小组的试验结果表明, 在所筛选的拮抗木霉菌中有些木霉菌菌株对立枯丝核菌、腐霉菌、镰刀菌、 辣椒疫霉菌 (Phytophthora capsici)以及水稻纹枯菌、 稻瘟菌等均有较强的抑菌作用。此外 ,有关拮抗木霉菌的发酵生产工艺及其制剂剂型的研究我们也取得了较好的进展。6拮抗
17、木霉菌的应用前景任何一种生防制剂的成功应用都与其所处的环境条件密切相关。由于目前生产上使用的多为孢子活菌制剂, 因此常常受到田间的温度、湿度、雨水及化学农药的等因素的干扰。我们研究小组的试验表明: 从不同抑菌土壤中分离的拮抗木霉菌在平皿培养条件下对多种植物病原菌有强烈的抑制作用, 或是以较快的生长速度占据营养空间, 或是以菌丝体直接缠绕到病原菌菌丝体上。但田间试验甚至盆栽试验结果表现极不稳定, 这也是所有的生防拮抗菌应用上的主要问题。 目前拮抗木霉菌生防制剂的开发研究方向: (1)采用生物技术如DNA重组技术、细胞质融合技术不断地创制新的具有耐化学农药( 杀虫剂、杀菌剂 ) 及耐不良环境 (
18、低温、 干燥 ) 的生防工程菌株 ; ( 2)实现化学农药与拮抗木霉菌生防制剂混合使用, 一方面可以提高生防制剂的防治效果 , 另一方面可以减少化学农药的使用剂量及农药的残留量; ( 3)不断寻找拮抗木霉菌的适宜发酵培养条件, 控制次生代谢水平, 提高制剂的抗生素产量, 增强防治效果; ( 4)改善田间施药环境条件, 促进拮抗木霉菌群体的定植能力和生存能力。参考文献 : 1 朱辉 , 娄沂春 . 利用城市垃圾发酵生产绿色木霉孢子 J . 微生物学通报, 1999, 26( 6) : 387-389. 2 杨依军 , 陈捷 . 以色列的生物防治J .世界农业 , 2000, ( 3) : 11-
19、13. 3 马平 , 沈崇尧 . 木霉菌和腐霉菌对棉铃疫病菌作用研究 J . 生物防治通报, 1993, 9( 3) : 122- 125. 4 焦棕 , 路炳声 , 等. 康氏木霉抑菌物质的抑菌效果 J . 中国生物防治, 1995, 11( 3) : 122-124. 5 田连声 , 王伟华 , 等. 利用木霉防治大棚草莓灰霉病 J . 植物保护 , 2000, 26( 2) : 47-48. 6 Geremia R A, Gold an G H, Jacobs D Belgir ate. 4thIntern ational T ric hoderma and Glioclodium Wo
20、rk shop( Abs tracts ) Z .Italy , 1993, 130-131. 7 GhisalbertiE L, Sivasithampar am K. Antifu ngal antibioticsproducedby T hrichod erma spp J . Soil Biol Biochem,1991, 23: 1011-1020. 8 Har a S, SchicklerH, OppenheimA, et al. New components of the chitinolyticsystem of Tr ichoder ma harz ianum J.Mycol
21、. Res, 1999, 94: 441- 446. 9 KubicekC P, Harman G E. T richod erma and Glioclad ium J . T alyer and Francis, 1998, 1: 1- 25. 10 Lorito M , Hayes C K, Pitro D A, et al . Purificationcharacterizationand synergis tic activityof a glucan 1, 3- -glucos idaseand an N-acetyl- -glucosaminidase fromTr ichode
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23、nthesis is a major tar get of m ycoparasitic antagon ism by T richod ermaharz ianum J . J. Bacteriol,1996, 178: 6382- 6385. 13Woo S L,Donzelli B,Scala F,et al.Discruptionof the ech42(endochitinas e-encodin g)gene affects biocontrolactivityinT richoder ma har zianum P1 J . MPM I, 1999, 12( 5) : 419-4
24、29. 14 Ziman d G, Elad Y, Chet I. Effect of T ric hoderma har zianum on B otry tis cinerea pathogenicity J . Phytopathology , 1996,?32? 天津农业科学第6 卷名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 5 页 - - - - - - - - - 86( 11) : 1255-1260.Approachto the Role of Ant
25、ifungalTrichodermain BiologicalControlYANGYi- jun1,WANGYong1,YANGXiu- rong1, QI Zhong- bo2, CHENG Gen-wu3( 1.TianjinInstituteof Plant Protection,T ianjin300112;2. T ianjin Committee of Science and Techn ology, Tianjin300042;3. Departmentof PlantProtection, Shenyang AgriculturalU nivers ity, China)Ab
26、stract : T heresearchcharacteristics,antifungalmecharnisim , r ecombinationgeneengineering for strainfermentatio n,and form ulatingpreparationas a metho d of biolog icalcontrolagainstplantpathog ens,of Trichodermawere mini-reviewed in thisarticle.T heperspective of antifungalTrichoderma in the appli
27、catio n of biological contro l was analysed.Key words : T richoder ma; biolog ical control ; antifung al activity 中国农业科学2001 年征订启事双月刊 , 国内外公开发行, 2001 年改为大16 开, 页码增加至120 页, 每期定价不变, 仍为15 元, 全年定价90 元。国内统一刊号 : CN11-1328/ S, 国内 邮发代号 : 2138, 国外代 号:BM 43。广告经营许可证: 京海工商广字第0256 号。漏订者可直接与编辑部联系补购。地址 :100081北京白石
28、桥路30 号;电话 : (010) 6891980868976244欢迎订阅山西农业科学季刊 ,大 16 开本 , 64 页码。每期 4. 00 元, 全年 16. 00 元。国内统一刊号CN14-1113/ S,邮发代号 2224。地址 :太原市长风街2 号邮政编码 : 030006欢迎订阅 2001 年 吉林农业科学双月刊 , 逢双月 25 日出版 , 16 开本 , 56 页, 每期定价 2. 80 元, 全年 16. 80 元。全国各地邮局均可订阅 , 如在邮局订阅有困难,也可直接与本刊编辑部联系订阅。地址 :吉林省公主岭市西兴华街6 号电话 : (0434) 6257384邮政编码 : 136100?33?第 3 期杨依军等: 拮抗木霉菌在生物防治中的作用名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 5 页 - - - - - - - - -