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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-dateIL-6-诱导LNCaP-上皮间质转化(EMT)并增强细胞对抗雄IL-6 诱导LNCaP 上皮间质转化（EMT）并增强细胞对抗雄激素药物的耐药性二甲双胍抑制IL-6诱导的LNCaP增殖及上皮间质转化章国亮1，姜 庆1，江 军2 （400010 重庆，重庆医科大学附属第二医院泌尿外科1；400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科2）摘要 目的 探索二
2、甲双胍抑制前列腺癌发展的作用机制。方法 使用慢病毒感染构建IL-6过表达细胞株LNCaP-IL-6（IL-6过表达病毒转染）和LNCaP-ctr（空病毒转染），运用激光共聚焦扫描确定转染效果，ELISA检测LNCaP、LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞IL-6分泌水平，倒置显微镜观察细胞形态。实验分为LNCaP-ctr组、LNCaP-IL-6组、LNCaP-ctr+二甲双胍组和LNCaP-IL-6+二甲双胍组，MTT技术检测相对细胞数量，流式细胞技术检测二甲双胍对细胞周期的影响；Western blot检测LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞TWIST和E-Cadherin表
3、达水平。实验分为LNCaP-IL-6和LNCaP-IL-6+二甲双胍组，运用细胞迁移实验检测两组细胞迁移速度，Western blot技术检测两组细胞TWIST和E-cadherin表达水平。结果 激光共聚焦扫描和ELISA检测证明IL-6过表达细胞株LNCaP-IL-6构建成功，LNCaP-IL-6细胞IL-6分泌水平约为LNCaP-ctr的5 000倍。MTT实验显示第5天LNCaP-IL-6相对细胞数量约为LNCaP-ctr的1.4倍，二甲双胍对LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr的抑制率分别为0.58和0.65，处理组的LNCaP-IL-6相对细胞数量约为LNCaP-ctr的1.6
4、倍；流式细胞仪检测显示二甲双胍阻滞LNCaP的细胞周期为S期。细胞形态学观察和Western blot检测证实IL-6诱导LNCaP发生上皮间质转化，细胞迁移实验显示二甲双胍可抑制LNCaP-IL-6细胞的迁移，Western blot进一步证实二甲双胍降低LNCaP-IL-6 TWIST表达及升高E-Cadherin表达。结论 二甲双胍能够抑制IL-6诱导的LNCaP细胞的上皮间质转化。关键词 前列腺癌；二甲双胍；上皮间质转化；LNCaP中图法分类号 文献标志码 A基金项目 国家自然科学基金（81172442/ H1619）；重庆市国际合作项目（2011GZ0047）通信作者 姜 庆，E-m
5、ail:jq001002；江 军，E-mail: jiangjun1964Metformin inhibits IL-6 induced LNCaP proliferation and epithelial-mesenchymal transitionZhang Guoliang1， Jiang Qing1， Jiang Jun2 (Department of Urology , The Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010;Department of Urology , Dapin
6、g Hospital/Institute of Surgery Research, The Third Medical University, Chongqing 400042) Abstratc Objective Detecting the mechanism by which metformin inhibits prostate cancer progression.Methods lentivirus transfection was used to construct IL-6 over-expressing LNCaP stable cell line（LNCaP-IL-6） a
7、nd LNCaP control cell line（LNCaP-ctr）,Then laser scanning confocal microscope and ELISA assay was used to confirm IL-6 over-expressing LNCaP cell line; morphology of the cells was observed under inverted microscope;The following experiments were carried out on the four groups:LNCaP-ctr，LNCaP-ctr wit
8、h metformin，LNCaP-IL-6 and LNCaP-IL-6 with metformin.MTT assay was used to detect cell relative number,Flowcytometry was used to analyse the affection of metformin on cell cycle; wound healing assay was used to detect the invasive ability of LNCaP-IL-6 either with or without metformin. Western blot
9、assay was used to detect E-Cadherin and TWIST expression level of LNCaP-ctr and LNCaP-IL-6，and the alteration of them after treated with metformin. Results Laser scanning confocal microscope scanning and ELISA assay attest that the construction of LNCaP-IL-6 is successful,the secretion level of IL-6
10、 by LNCaP-IL-6 was 5000 the amount of LNCaP-ctr.MTT assay indicated that LNCaP-IL-6 relative cell number was 1.4 times the amount of LNCaP-ctr and in metformin treated group it is up to 1.6 times after cultured for 5 days，the inhibition rates of LNCaP-IL-6 and LNCaP-ctr are 0.58 and 0.65 respectivel
11、y. Flowcytometry results indicated that metformin arrest LNCaP cycle in S phage .Morphology observation and western blot show EMT among LNCaP-IL-6 cells.Wound-healing assay proved that metformin inhibited LNCaP-IL-6 migration .Western blot showed a decrease in TWIST level and a promotion in E-Cadher
12、in level .Conclusion This study demonstrate that metformin reverses IL-6 induced LNCaP cell epithelial-mesenchymal transition .Key words Prostate cancer Metformin EMT LNCaP Supported by nature science foundation of China （81172442/ H1619）,and international cooperation projects foundation of ChongQin
13、g（2011GZ0047）.Corresponding author:Jiang Qing,E-mail: jq001002；Jiang Jun,E-mail: jiangjun1964-上皮间质转化是前列腺癌进展的重要机制之一。新近文献表明IL-6在前列腺癌的进展中起重要作用1。IL-6主要是以自分泌或旁分泌生长因子的方式促进前列腺癌的发展1，它还能够诱导乳腺癌、胰腺癌等多种癌细胞发生间质化（EMT）而使细胞获得侵袭和生存能力更强的表型2-3。二甲双胍是治疗2型糖尿病常用的药物之一，具有潜在的抗癌作用，流行病学研究显示服用二甲双胍的糖尿病患者患癌风险低于未服药者，服用二甲双胍的癌症患者预后也
14、好于未服用者6。二甲双胍被证明在体外能杀死多种癌细胞7-8。本研究通过构建IL-6过表达前列腺癌LNCaP细胞株(IL-6过表达病毒转染,LNCaP-IL-6），检测IL-6对LNCaP增殖的调节作用，结合细胞形态学观察和Western blot检测，证实IL-6诱导LNCaP上皮间质转化作用。用2 mmol/L二甲双胍处理LNCaP-ctr（空病毒转染）和LNCaP-IL-6，检测二甲双胍是否逆转IL-6诱导的LNCaP的增殖优势和上皮间质转化，探索二甲双胍抗前列腺癌的可能机制。1 材料与方法1.1 材料RMPI1640培养基、胎牛血清、胰酶、PBS均购自Hyclone公司，慢病毒（pSB3
15、88 IL-6过表达慢病毒和pSB33对照病毒）购自上海生博医学生物工程科技有限公司，TWIST多抗购自Santa Cruz公司，E-cadherin购自Epitomics公司，ELISA试剂盒（CHE0009）购自北京四正柏生物科技有限公司，凝胶配置试剂盒（KPG113）和MTT试剂盒（KGA311）购自凯基公司。1.2 LNCaP细胞培养LNCaP细胞株由第三军医大学西南医院中心实验室提供，用含10%（体积分数）胎牛血清的1640培养基培养，孵箱培养条件为37 、5% CO2.。1.3 IL-6过表达慢病毒感染实验取处于对数期生长的LNCaP细胞，培养瓶中细胞饱和度80%，胰酶消化后进行活
16、细胞计数，调整细胞数为1105/mL，以2104/孔接种到24孔板。实验分为3组：IL-6过表达病毒组（pSB388）、对照病毒组（pSB33）、正常组。IL-6过表达病毒（pSB388）和对照病毒（pSB33）滴度分别为5.34108、1.22109 TU/mL，以MOI值为20计算，每孔加入的病毒数量为4105 TU。感染8 h后，弃上清，更换为新鲜培养基，400 L/孔，于第3天观察绿色荧光表达情况，出现绿色荧光表达后加入含2 g/mL飘零霉素的RMPI1640完全培养基对阳性细胞进行纯化筛选，以1 g/mL嘌呤霉素的完全培养基维持培养。将细胞依次转移到6孔板和培养瓶进行传代扩增并冻存细
17、胞株。1.4 ELISA鉴定IL-6过表达LNCaP细胞株取处于对数期生长的LNCaP-IL-6、LNCaP-ctr和LNCaP细胞，胰酶消化后进行活细胞计数，调整细胞数为1105/mL，将细胞以5104/孔接种于24孔板，每种细胞设3个复孔。次日更换新鲜培养基，400L/孔，第3天收集上清做ELISA分析。标准品的稀释和加样：加入1.0 mL稀释液至冻干标准品中，待彻底溶解后，震荡混匀；准备7个干净的EP管,第1个EP管加入750 L的稀释液，其余加入500 L稀释液。取溶解后的标准品250 L加入1号EP管内，混匀后从1号取500 L加入2号管，混匀后再从2号管取500 L加入第3个EP管
18、，依此方法对标准品进行梯度稀释，使EP管内标准品浓度依次为250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9 pg/mL。加样：实验组设3个复孔，另设1个空白孔，加入100 L样品和标准品至反应孔内37 ，90 min；加入生物素化抗体工作液100 L/孔，37 ，60 min；加入酶结合物工作液100 L/孔，37 ，30 min加入显色剂100 L/孔，37 ，10 min；加入终止液100 L/孔，混匀，测D（450）值。标准品和样品的检测结果运用Excel 2003软件得出标准曲线和公式，并计算样品中IL-6的浓度。1.5 MTT细胞增殖分析实验分组：LNCaP-ctr
19、组、LNCaP-IL-6组、LNCaP-ctr+2 mmol/L二甲双胍组和LNCaP-IL-6+2 mmol/L二甲双胍组。取处于对数期生长的LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞，胰酶消化后进行活细胞计数，调整细胞数为5104/mL，按5 000/孔接种到4个96孔板，每组设6个复孔，用10% FBS 1640培养基进行培养，于接种后的第1、3、5天进行MTT实验，结果用SPSS 18.0统计软件进行检验。1.6 流式细胞检测细胞周期 取处于对数期生长的LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞，胰酶消化后制成细胞悬液并进行活细胞计数，以3105/孔接种于6孔板，24 h后更换新鲜
20、完全培养基并给实验组细胞培养基中加入2 mmol/L的二甲双胍共培养48 h，PBS洗涤细胞2遍，加入胰酶消化，1 000 r/min离心3 min，弃上清，加入PBS洗涤1次，离心，弃上清，加入300 L PBS重悬细胞，加入700 L无水乙醇固定，4 过夜，于次日进行流式细胞仪检测。1.7 细胞划痕修复实验 取处于对数期生长的LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞，按3105/孔接种于6孔板，待细胞汇合率达到90%即进行实验。用10 L规格Tip头于6孔板正中划一横线使细胞脱落，用PBS缓冲液洗去脱落细胞，加入含1%活性炭过滤的胎牛血清（CS-FBS）培养基1 mL/孔，实验组培养基
21、中加入2 L 1 mol/L的二甲双胍，使其终浓度为2 mmol/L，对照组培养基中加入等体积的PBS，分别于划痕后0、24、48 h于倒置显微镜下观察细胞迁移情况并采图。1.8 Western blot检测取处于对数期生长的LNCaP-IL-6和LNCaP-ctr细胞，胰酶消化后制成细胞悬液并进行活细胞计数，以3105/孔接种于6孔板，48 h后取出用预冷的PBS洗3遍，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白。LNCaP-IL-6在接种24 h后换液并加入2 mmol/L二甲双胍处理48 h，提取总蛋白。Western blot分析E-cadherin、TWIST的表达水平的变化。1.9 统计学方法采
22、用 SPSS 18.0 统计软件，数据以xs表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法。2 结果2.1 LNCaP细胞转染后IL-6表达的检测慢病毒感染成功后，用ELISA和荧光显微镜检测目的基因的表达（图1、2）。构建的慢病毒基因组中均带有绿色荧光蛋白基因，LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6均带有较强的绿色荧光，表明慢病毒基因组在宿主细胞中稳定表达。LNCaP-IL-6组IL-6表达量为（5 802128.09）pg/mL，LNCaP-ctr组为（1.140.19）pg/mL，LNCaP组为（1.980.84）pg/mL。A：LNCaP-IL-6绿色荧光标记 B：LNC
23、aP-IL-6对照;C：LNCaP-ctr绿色荧光标记;D：LNCaP-ctr对照图1 绿色荧光标记显示病毒感染效率2.2 二甲双胍对LNCaP-ctr及LNCaP-IL-6细胞增殖及迁移的影响LNCaP-ctr细胞形态规则，排列紧密，呈鹅卵石状或多角形；而LNCaP-IL-6细胞呈纺锤状和长梭形，细胞排列散乱，说明IL-6有诱导LNCaP细胞上皮间质转化倾向（图2）。MTT细胞增殖实验结果显示无二甲双胍处理LNCaP-IL-6表现出较为明显的快于LNCaP-ctr细胞的生长优势；而在含有2 mmol/L二甲双胍的完全培养基培养条件下，LNCaP-ctr细胞和LNCaP-IL-6细胞的增殖均受
24、到一定程度的抑制，但LNCaP-IL-6细胞受抑制的程度小于LNCaP-ctr细胞（图3）。细胞划痕修复实验显示在划痕后48 h，LNCaP-IL-6细胞缺口已接近愈合状态，而对照划痕缺口仍比较明显（图4）。ABA：LNCaP-ctr组；B：LNCaP-IL-6组图2 倒置显微镜 LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6形态观察，放大倍数400Xabaaa1、 LNCaP-ctr；2、LNCaP-ctr+2 mmol/L二甲双胍组；3、LNCaP-IL-6；4、LNCaP-IL-6+2 mmol/L二甲双胍组图3中LNCaP-IL-6+met改为LNCaP-ctr+2 mmol/L二甲双胍组，
25、LNCaP-IL-6+met改为LNCaP-IL-6+2 mmol/L二甲双胍组a： P0.05，与相应对照组比较；b： P0.05，与LNCaP-ctr组比较图3 MTT法检测二甲双胍对LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6增殖的影响1： LNCaP-IL-6对照起始； 2： LNCaP-IL-6+2 mmol/L二甲双胍组起始；3：LNCaP-IL-6对照48 h；4：LNCaP-IL-6+2 mmol/L二甲双胍组48 h图4 划痕实验检测二甲双胍对LNCaP-IL-6细胞迁移的影响2.3 二甲双胍对LNCaP细胞周期的影响二甲双胍处理组S期细胞比例明显高于对照组，差异有统计学意义（P
26、0.05，表1）。表1 二甲双胍对LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6细胞周期的影响 n=3，（xs）%组别G1SG2LNCaP-ctr68.230.815.870.6415.91.4LNCaP-ctr +2 mmol/L二甲双胍组54.160.7832.971.26a12.870.97LNCaP-IL-662.930.5922.332.9714.742.43LNCaP-IL-6+2 mmol/L二甲双胍组59.251.0731.560.94a9.191.85aa：P0.05，与未加二甲双胍组对比2.4 二甲双胍对LNCaP-IL-6 TWIST和E-Cadherin蛋白表达的影响LNCa
27、P-ctr组TWIST和E-Cadherin蛋白相对比值分别为（0.130.01）和（0.510.05），LNCaP-IL-6组分别为（0.430.02）和（0.190.02）。两组间TWIST和E-Cadherin表达差异有统计学意义（P0.05）。加入二甲双胍处理的LNCaP-IL-6细胞TWIST和E-Cadherin相对比值分别为（0.310.03）和（0.740.06），未加二甲双胍处理的LNCaP-IL-6细胞TWIST和E-Cadherin相对比值分别为（0.670.04）和（0.230.02），二甲双胍处理组TWIST表达水平低于对照组，而E-Cadherin高于对照组，差异有
28、统计学意义（P0.05,图5）。-actin（43103）E-cadherin（120103）TWIST（20.9103）1 23 41：LNCaP-ctr；2：LNCaP-IL-6；3：LNCaP-IL-6处理48 h；4：LNCaP-IL-6+2 mmol/L二甲双胍组处理48 h图5 Western blot检测LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6细胞TWIST和E-cadherin蛋白的表达3 讨论本实验证明治疗2型糖尿病的药物二甲双胍可明显抑制前列腺癌细胞株LNCaP的增殖，并逆转IL-6诱导的LNCaP细胞上皮间质转化过程。上皮间质转化是指上皮细胞的表型向间质细胞转变，其过程伴
29、随EMT转录因子的激活，E-cadherin表达缺失和细胞极性转换。在肿瘤细胞中发生EMT的细胞由于细胞间连接的缺失而更容易迁移。人类的TWIST是一种重要的EMT调节基因9，TWIST高表达与癌症的抗凋亡、耐药和血管生成有关10。TWIST高表达引起E-Cadherin表达下降，使癌症患者更容易发生转移11。本实验通过对LNCaP细胞进行慢病毒感染，获得IL-6过表达的LNCaP-IL-6稳定细胞株。MTT实验显示在细胞培养第5天，LNCaP-IL-6的相对数量约为LNCaP-ctr的1.4倍，说明自分泌的IL-6能够明显促进LNCaP细胞的增殖；2 mmol/L的二甲双胍能够显著抑制LNC
30、aP-ctr和LNCaP-IL-6的增殖，但对二者的抑制程度不一，MTT第3天和第5天结果显示LNCaP-IL-6对二甲双胍的抵抗性大于LNCaP-ctr，其机制可能与IL-6的生长促进作用有关。流式细胞仪检测显示二甲双胍处理后的LNCaP-ctr和LNCaP-IL-6的S期细胞比例增多，表明二甲双胍阻滞LNCaP的细胞周期为S期。细胞形态观察显示以10%的CS-FBS维持培养48 h后，LNCaP-IL-6细胞呈纺锤状和长梭形，细胞排列散乱，而LNCaP-ctr细胞形态规则，排列紧密，呈鹅卵石状或多角形，说明IL-6可诱导LNCaP细胞向间质细胞的表型转变；Western blot实验显示L
31、NCaP-IL-6的TWIST水平显著高于LNCaP-ctr，而E-Cadherin表达水平低于LNCaP-ctr，表明自分泌的IL-6能够诱导LNCaP上皮间质转化。新近研究发现IL-6能够提高TWIST蛋白的稳定性引起头颈部癌细胞的迁移能力增强12，本实验结论与之相符。细胞迁移实验表明二甲双胍能够抑制LNCaP-IL-6细胞的迁移，同时Western blot检测显示二甲双胍处理的LNCaP-IL-6细胞的TWIST蛋白水平下降，E-cadherin水平上调，说明二甲双胍通过抑制TWIST表达而降低E-Cadherin表达水平，从而实现对IL-6过表达诱导的LNCaP细胞上皮间质转化的逆转
32、。研究显示，二甲双胍能够激活MAPK而引起下游靶基因mTOR的抑制，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的13-14。本研究表明IL-6过表达细胞株LNCaP-IL-6细胞株TWIST表达明显高于LNCaP-ctr，这与IL-6调节癌细胞的增殖、粘附、分化和抗凋亡有关15。二甲双胍对TWIST表达有显著的抑制作用，我们推测TWIST也可能是MAPK下游基因，二甲双胍经MAPK/TWIST途径，对前列腺癌细胞上皮间质转化进行控制，抑制前列腺癌细胞的转移。本研究尚未进行MAPK相关检测，需要进一步研究证实MAPK对TWIST是否存在调控。上皮间质转化是前列腺癌的发生与发展的重要机制，IL-6是诱导前列腺癌
33、上皮间质转化的重要调节因素。本细胞实验证明，二甲双胍抑制前列腺癌细胞上皮间质转化是其抗前列腺癌的重要机制之一，有关二甲双胍在前列腺癌方面的研究尚不充分，其抗前列腺癌的详细分子机制有待进一步探讨。参考文献：1Azevedo A, Cunha V, Teixeira A L, et al. IL-6/IL-6R as a potential key signaling pathway in prostate cancer development J. World J Clin Oncol, 2011, 2(12): 384-396.2Sullivan N J, Sasser A K, Axel A
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