最新hcy生产工艺研究.doc

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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-datehcy生产工艺研究hcy生产工艺研究同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）主要生产工艺及反应体系的研究资料设计思想：同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）原理为样本中的同型半胱氨酸被转化为游离型后，通过与共价底物反应，产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH）转化为NAD+，样本中的同型半胱氨酸的浓度与NADH的变化成正

2、比。同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）主要生产工艺过程的研制及试剂盒反应体系的建立主要分为三个部分即：生产工艺(主要是试剂配方)的研制、试剂盒组成的研制、试剂盒反应体系的建立。产品拟定标准：准 确 度：以本公司制备的质控品为检测样本时，测定值相对偏差R20%;线 性 范 围：Hcy试剂在拟定线性范围内，回归系数r应不小于0.990;分析灵敏度：Hcy含量为10umol/L时，测定吸光度变化率(减掉试剂空白吸光度变化率) A 0.002Abs/min测量精密度：用质控品重复测定10次，测试所得的结果，变异系数CV10%1主要生产工艺描述及确定依据1.1试剂配方的确定依据由于生化试剂的特殊性，所谓主要

3、生产工艺参数的确定即是试剂配方的确定。试剂处方的确定依据主要来源：Pastore A，et al. Fully automated assay for total homocysteine, cysteine, cysteinylglycine, glutathione, cysteamine, and 2-mercaptopropionylalycine in plasm and urine. Clin. Chem, 1998,44(4) :825-8291.2试剂配方的研制 根据产品的性质，将试剂设计为双试剂。其中R1主要成分为tris缓冲液，S-腺苷甲硫氨酸盐、-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原

4、性、三（2羧乙基）磷氯化氢、- 酮戊二酸、修饰化Hcy甲基转移酶、谷氨酸脱氢酶，R2主要成分为tris缓冲液、修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶、腺苷脱氨酶。1.2.1基础配方的研制1.2.1.1实验方案：根据正交实验的原则，设计具体方案如下:R1试剂： ph7.5配方一：tris缓冲液 100mmol/LS-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.2mmol/L -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.3mmol/L 三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.7mmol/L 酮戊二酸 4.0mmol/L 修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 3.0KU/L 谷氨酸脱氢酶（GLDH） 5.

5、0KU/L配方二：tris缓冲液 100mmol/LS-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.3mmol/L -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.1mmol/L 三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.6mmol/L 酮戊二酸 5.0mmol/L 修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 4.0KU/L 谷氨酸脱氢酶（GLDH） 10.0KU/L配方三：tris缓冲液 100mmol/LS-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.1mmol/L -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.2mmol/L 三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.5mmol/L 酮戊二酸 5.0mmol/L 修饰化Hcy

6、甲基转移酶（HMTase） 5.0KU/L 谷氨酸脱氢酶（GLDH） 10.0KU/L配方四：tris缓冲液 100mmol/LS-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.05mmol/L -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.1mmol/L 三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.3mmol/L 酮戊二酸 6.0mmol/L 修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 15KU/L 谷氨酸脱氢酶（GLDH） 10.0KU/LR2试剂：ph7.5配方一：tris缓冲液 100mmol/L修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶 2.5KU/L 腺苷脱氨酶 4.0KU/L配方二：tris缓冲液 10

7、0mmol/L修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶 3.0KU/L 腺苷脱氨酶 5.0KU/L配方三：tris缓冲液 100mmol/L修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶 3.5KU/L 腺苷脱氨酶 5.5KU/L1.2.1.2实验方法按照以上配方分别进行试剂配制，并按产品标准的要求，用本公司生产的工作校准品和质控品按照以下方法进行检测。比较各试剂的线性相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。加入物空白管标准管标本管DH2O13ul标准13ul样本13ulR1240ul240ul240ul混匀，37温育5分钟R265ul65ul65ul加入R2混匀，温育180秒后，连续监测2分钟的

8、吸光度变化值(A/min)1.2.1.3实验结果R1 R2 配方组合线性相关系数分析灵敏度准确性精密度R1(一) R2(一)0.98350.0125.90%5.18%R1(二) R2(一)0.98770.0144.99%4.95%R1 (三)R2(一)0.98920.0154.06%4.76%R1(四) R2(一)0.99160.0133.45%3.75%R1(一)R2(二)0.99430.0192.91%3.32%R1(二) R2(二)0.99600.0252.86%3.25%R1 (三)R2(二)0.99890.0312.29%2.21%R1(四) R2(二)0.99710.0262.55

9、%3.22%R1(一)R2(三)0.99290.0294.12%3.84%R1(二) R2 (三)0.99380.0164.26%4.00%R1 (三)R2(三)0.99020.0224.72%4.72%R1(四) R2(三)0.98960.0216.41%6.04%1.2.1.4实验结论结果显示R1配方(三)与R2配方(二)进行组合时试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他组合，因此基础配方R1试剂均按照配方(三)、R2试剂均按配方（二）进行配制。1.2.2试剂最适pH值的确定1.2.2.1实验方案：根据pH值对酶活性以及试剂反应速率的影响，R1和R2试剂设计了以下三种pH值

10、：R1试剂 pH：7.0、7.5、8.0R2试剂 pH: 7.0、7.5、8.0分别按照基础配方配制三种不同pH值的R1和R2试剂，按照1.2.1.2的实验方法，比较各试剂的线性相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。1.2.2.2实验结果：R1 pHR2 pH线性相关系数分析灵敏度准确性精密度7.07.00.98540.0167.55%6.72%7.57.00.99170.0134.10%5.83%8.07.00.98730.0244.19%4.76%7.07.50.99140.0254.02%3.73%7.57.50.99880.0302.58%2.16%8.07.50.99230.0233

11、.78%4.42%7.08.00.99030.0244.13%4.74%7.58.00.98840.0204.78%5.04%8.08.00.98100.0186.02%6.54%1.2.2.3实验结论：结果显示，当R1试剂的pH值为7.5和R2试剂的pH值为7.5时，试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他pH值；因此，最后确定试剂R1试剂的pH值为7.5和R2试剂的pH值为7.5。1.2.3稳定剂1.2.3.1实验方案稳定剂BSA主要用于试剂的保护。在基础配方R1、R2加入不同浓度的稳定剂，其它原料按基础配方进行配制；将R1、R2置于37水浴箱中，按照1.2.1.2的实验方

12、法，分别在0小时、48小时、96小时、144小时进行检测，比较各试剂的分析灵敏度的变化。基础配方R2稳定剂的浓度分别按0g/L、0.5g/L、1.0g/L、 1.5g/L进行配制。1.2.3.2实验结果稳定剂浓度分析灵敏度0小时48小时96小时、144小时0g/L0.0300.0260.0220.0180.5g/L0.0310.0300.0290.0291.0g/L0.0300.0280.0250.0231.5g/L0.0300.0280.0240.0211.2.3.3实验结论：结果显示当稳定剂的浓度为0.5g/L时，试剂分析灵敏度数值优于其他浓度；同时实验显示，稳定剂的浓度过高，会影响试剂的

13、灵敏度。因此，最后确定试剂R1、R2加入稳定剂的最佳浓度为0.5g/L。1.3最终的试剂配方 R1试剂（每1000ml） pH7.5主要原材料来 源浓度质量trisAmresco公司100mmol/L12.11gHCl北京化工厂/S-腺苷甲硫氨酸盐Sigma公司0.1mmol/L43.49mgNADHAmano公司0.2mmol/L141.88mgTCEPSigma公司0.5mmol/L143.13mg酮戊二酸Amresco公司5.0mmol/L730.5mg修饰化Hcy甲基转移酶ASAHI公司5.0KU/L/谷氨酸脱氢酶Toyobo公司10.0KU/L/纯化水自制定容至1000ml/ R2试

14、剂（每1000ml） pH7.5主要原材料来 源浓度质量trisAmresco公司/12.11gHCl北京化工厂1mol/L/修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶ASAHI公司5.0KU/L/腺苷脱氨酶Sigma公司3.0KU/L/BSARoche0.5g/L0.5g纯化水自制定容至1000ml/以上数据均是参考“Pastore A, Massoud R, Mott C, et al. Fully autom ated assay for total homocysteine,cysteine, cysteiny lglycine，glutathione,cysteamine, and

15、2-mercaptopropionylalycine in plasm and urine.Clin Chem,1998,44(4) :825-829”文献中的有关资料，经过反复多次实验，最终确定的数据。1.4主要生产工艺描述见附件一：生产工艺流程图2反应体系的组成2.1反应体系组成：反应体系主要由R1试剂、R2试剂、校准品、产品使用说明书等几部分组成。2.2试剂规格：根据不同客户、不同仪器的要求。我们开发了以下几种规格的试剂：R1-11 mlR2-3mlR1-17.5 mlR2-4.5mlR1-22 mlR2-6mlR1-33 mlR2-9mlR1-233 mlR2-29 mlR1-66 m

16、lR2-18 mlR1-266 mlR2-218 mlR1-233 mlR2-18mlR1-433 mlR2-218mlR1-811 mlR2-83ml2.3校准品含量： 每批定值。3.被测样本的要求样本为新鲜血清或血浆（肝素抗凝）。请采血后立即离心分离血浆，或冷藏保存1小时内分离，离心后的样本在室温下可稳定4天，02可稳定数周，-20下可稳定数月或数年。4.试剂用量4.1试剂用量的确定4.1.1实验方案：试剂用量的确定主要是R1与R2试剂配方一定的条件下，二者加入比例的确定。实验方法: 样本加入量为13ul，R1与R2试剂加入量分别按165ul:140ul、195ul:105ul、235ul

17、:75ul、240ul:65ul、250ul:55ul。按配方配制R1与R2试剂，并按产品标准的要求，用本公司校准品和质控品按照以下方法进行检测。比较各试剂的线性相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。4.2.2实验结果R1:R2线性相关系数分析灵敏度准确性精密度165ul:140ul0.97670.0136.16%7.05%195ul:105ul0.98560.0255.43%5.43%235ul:75ul0.99240.0283.24%3.55%240ul:65ul0.99890.0302.55%2.86%250ul:55ul0.99320.0113.33%4.58%4.2.3实验结论：结果

18、显示，试剂加入比例R1：R2为240ul:65ul时，试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他比例；因此，最后确定试剂加入比例R1：R2为240ul:65ul。4.2样本加入量的确定：4.2.1实验方法：取配制合格的R1、R2试剂，用企业内部校准品、质控品进行检测，样本使用量分别按10ul 、13 ul 、16ul 、19ul 进行， R1、R2试剂加入量分别为240ul、65ul；按照1.2.1.2的实验方法，比较各样本加入量的相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。4.2.2实验结果样本加入量线性相关系数分析灵敏度准确性精密度10ul0.99230.0232.75%4.25%

19、13ul0.99860.0302.14%2.41%16ul0.99450.0263.06%3.88%19ul0.99100.0283.84%5.26%4.2.3实验结论：结果显示样本加入量为13ul时，试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他样本加入量；因此，最后确定样本加入量为13ul。样本加入量: R1 : R2 = 13l : 240l : 65l注：样本、R1、R2的加入量可按比例进行放大和缩小。5.体系的反应条件5.1体系反应温度：375.2测定波长：主波长340nm 副波长700nm样本中的同型半胱氨酸被转化为游离型后，通过与共价底物反应，产生腺苷。腺苷立即水解成氨

20、和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH）转化为NAD+，样本中的同型半胱氨酸的浓度与NADH的变化成正比。NADH在340nm下有最大吸收，因此测定波长定在340nm。5.3比色杯光径：1cm5.4反应时间：5.4.1样本与R1混匀后温浴时间的确定5.4.1.1实验方案将样本与R1混合，分别置于37下温浴0分钟、1分钟、3分钟、5分钟、7分钟，按照1.2.1.2的实验方法进行检测，比较样本与R1混匀后温浴时间对试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值的影响。5.4.1.2实验结果样本与R1 温浴时间线性相关系数分析灵敏度准确性精密度0分钟0.98

21、940.0253.14%2.60%1分钟0.99730.0292.61%2.83%3分钟0.99740.0302.43%2.75%5分钟0.99830.0312.24%2.31%7分钟0.99480.0242.49%3.48%5.4.1.3实验结论：结果显示当样本与R1混匀后不进行温浴时，由于样本中的杂质干扰，试剂相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度明显偏低。而样本与R1混匀后温浴15分钟时，试剂相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度明显比较理想；因此，最后综合考虑，确定样本与R1混匀时间为15分钟。5.4.2吸光度测定时间的确定5.4.2.1实验方案将样本与R1混合，分别置于37下温浴 5分钟

22、，然后加入R2，按照1.2.1.2的实验方法进行检测，观察吸光度数值随时间的变化。5.4.2.2实验结果5.4.2.3实验结论：结果显示：至少在180秒内吸光度数值成线性关系。因此确定样本加入R2，温育3分钟然后在340nm下连续测定2-3分钟内各管吸光度变化值。5.4.3反应时间的最终确定：样本与R1温育1-5分钟后加入R2，温育3分钟后在340nm下连续测定2-3分钟内各管吸光度变化值。 6.体系的有效性确定方法6.1仪器：检验用仪器必须经过检定，并且在有效期内使用。6.2用在研究开发过程中所选择的原材料，按照生产工艺的要求，小批量生产三批产品，按照企业标准的要求，分别用企业内部校准品和质控品进行检测，结果均应符合标准的要求。6.3严格按照所确定的体系反应条件进行检测。7.有关验证资料7.1工艺验证方案7.2工艺验证报告7.3设计开发验证方案7.4设计开发验证报告7.5内包材验证方案7.6内包材验证报告 附件一：生产工艺流程图称量、配制工艺用水制备原料准备说明书准备试剂盒准备质控中间品性能指标抽检分 装试剂瓶准备试剂瓶准备瓶签准备装量抽检质控组 装盒封口签准备包装附属物状态抽检质控成品性能指标抽检入成品仓库10万级洁净车间 关键工序-