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1、第一章导论第一章导论1.1 生物工程的特征生物工程是属于应用生物科学和技术的一个领域， 它包含生物或其亚细胞组分在制造业、 服务业和环境管理等方面的应用。 生物技术利用病毒、 酵母、 真菌、藻类、 植物细胞或者哺乳动物培养细胞作为工业化处理的组成部分。只有将微生物学、生物化学、遗传学、分子生物学、化学和化学工程等多种学科和技术结合起来，生物工程的应用才能获得成功。生物工程过程一般包括细胞或菌体的生产和实现所期望的化学改造。 后者进一步分为：（a） 终产物的构建 例如，酶，抗生素、有机酸、甾类 ；（b） 初始原料的降解例如，污水处理、工业垃圾的降解或者石油泄漏 。生物工程过程中的反应可能是分解代
2、谢反应， 其中复合物被分解为简单物质葡萄糖分解代谢为乙醇 ， 又或者可能是合成代谢反应或生物合成过程 ，经过这样的方式，简单分子被组建为较复杂的物质抗生素的合成 。分解代谢反应常常是放能反应过程，相反的，合成代谢反应为吸能过程。生物工程包括发酵工程范围从啤酒、葡萄酒到面包、奶酪、抗生素和疫苗的生产 ，水与废品的处理、某些食品生产以及从生物治疗到从低级矿石种进行金属回收这些新增领域。正是由于生物工程技术的应用多样性，它对工业生产有着重要的影响，而且，从理论上而言，几乎所有的生物材料都可以通过生物技术的方法进行生产。据预测，到 2000 年，生物技术产品未来市场潜力近 650 亿美元。但也应理解，
3、还会有很多重要的新的生物产品仍将以化学方法，按现有的生物分子模型进行合成，例如，以干扰为基础的新药。因此，生命科学与化学之间的联系以及其与生物工程之间的关系更应阐释。生物工程所采用的大部分技术相对于传统工业生产更经济， 耗能低且更加安全，而且，对于大部分处理过程，其生产废料是经过生物降解的，无毒害。从长远角度来看， 生物工程为解决世界性难题提供了一种方法，尤其是那些有关于医学、食品生产、污染控制和新能源开发方面的问题。1.2 生物工程的发展历史与一般所理解的生物工程是一门新学科不同的是， 而是认为在现实中可以探寻其发展历史。事实上，在现代生物技术体系中，生物工程的发展经历了四个主要的发展阶段。
4、食品与饮料的生物技术生产食品与饮料的生物技术生产众所周知，像烤面包、啤酒与葡萄酒酿造已经有几千年的历史；当人们从创世纪中认识葡萄酒的时候，公元前 6000，苏美尔人与巴比伦人就喝上了啤酒；公元前 4000，古埃及人就开始烤发酵面包。直到 17世纪，经过列文虎克的系统阐述，人们才认识到，这些生物过程都是由有生命的生物体，酵母所影响的。对这些小生物发酵能力的最确凿的证明来自 1857-1876年巴斯得所进行的开创性研究，他被认为是生物工程的始祖。其他基于微生物的过程， 像奶制品的发酵生产如干酪和酸乳酪及各种新食品的生产如酱油和豆豉等都同样有着悠久的发展历史。 就连蘑菇培养在日本也有几百年的历史了，
5、有 300 年历史的 Agarius 蘑菇现在在温带已经有广泛养殖。所不能确定的是， 这些微生物活动是偶然的发现还是通过直观实验所观察到的， 但是，它们的后继发展成为了人类利用生物体重要的生命活动来满足自身需求的早期例证。最近，这样的生物过程更加依赖于先进的技术，它们对于世界经济的奉献已远远超出了它们不足为道的起源。有菌条件下的生物技术有菌条件下的生物技术19 世纪末，经过生物发酵而生产的很多的重要工业化合物如乙醇、乙酸、有机酸、丁醇和丙酮被释放到环境中；对污染微生物的控制通过谨慎的生态环境操作来进行，而不是通过复杂的工程技术操作。尽管如此，随着石油时代的来临，这些化合物可从石油生产的副产品中
6、以低成本进行生产，因此，进行这类化合物生产的工业就处于岌岌可危的境地。近年来，石油价格的上涨导致了对这些早期发酵工艺的重新审视，与前面所讲的食品发酵技术相比，这类发酵工艺相对简单而且可进行大规模操作生产。其它关于有菌生物技术的典型例子有废水处理和都市固体垃圾堆肥。 长期以来， 人们利用微生物来分解和去除生活污水中的有毒物质，及像化工业产生的小部分工业毒害垃圾。目前世界上进行的发酵工程中，利用生物工程进行污水处理的规模是最大的。将无菌消毒技术引入生物工程将无菌消毒技术引入生物工程20 世纪 40 年代，由于大规模微生物培养这个复杂的生物技术的引入，生物工程的发展开始了新的方向，从而确保那些需要将
7、污染微生物排除的特殊生物过程得以进行。因此， 通过对培养基和生物反应器的提前灭菌消毒以及用来消除新进入的污染物的工程供给， 生物反应中就只留有所选的生物催化剂。 诸如此类， 在生物工程中占有极大份额的产品有抗生素、 氨基酸、有机酸、酶、多糖和疫苗。大部分这样的过程是复杂的，成本昂贵，仅适于高附加值产品的生产，尽管这类产品的产量较大， 但采用食品与酿造生产中较老的生物技术，它们的规模与商业回报都是很小的。生物工程的新领域生物工程的新领域在最近的十年里，分子生物学和过程控制取得了长足的发展， 不见开创了生物工程应用的新领域，同时还大大提高了已有生物工程工业的效率和经济性。 正是由于这些发现和发展，
8、才会有对于未来生物工程在世界经济中所扮演角色的良好评价。（a） 基因工程对于重要的工业用生物基因组的有性重组或突变操作一直是工业遗传学家革新目录中的组成部分。重组DNA 新技术包括温和的进行活细胞破碎、DNA 提取、纯化和利用高度专一性的酶进行随后的有选择性切割；对目的基因片断分类、鉴定、筛选和纯化；用化学方法将目的基因连接到载体分子的 DNA 上及将重组 DNA 分子导入选择的受体细胞进行增值和细胞合成。重组 DNA 技术可较简便的进行基因组操作，而且可防止物种间与属间的不相容性。无限可能性是存在的，人类胰岛素与干扰素基因已导入了微生物细胞并进行了表达。原生质融合、 多克隆抗体制备和组织培养
9、技术 包括从细胞培养上清液中进行植物的再生的广泛应用对生物工程的发展有着深远的影响。（b） 酶工程酶别离工程一直是许多生物技术过程的组成部分， 而且随着允许对生物代谢产物进行重新利用的更适合的固定化技术的发展， 它们的代谢产物可被进一步利用。 利用固定化细菌的葡萄糖异构酶生产高果糖浆，其发展具有特殊的重要意义年产 300 万吨 。基于生物催化的目的，未来的发展是细胞整体的固定化。（c） 生物化学工程生物反应器在生物工程过程中扮演了核心角色， 它在初始原料或底物与终产物之间建立了联系。生物反应器设计、 过程调控技术与发酵过程的电脑监控方面取得了重要进展。尽管如此，许多年来，过程控制在生物工程工业
10、领域中的应用落后其在化学工程工业领域操作中的应用，对生物工程产品新的处理方法下游工程将提高所有处理过程的经济性。因此，对高效回收工艺的设计的需求不断增加，尤其对于具有高价值产品例如 L-天冬酰胺酶，其回收与发酵生产的成本比例约为 3.0，而乙醇为 0.16。然而，下游处理过程仍是生物工程中被无视的部分。（d） 工程化产品和系统利用蛋白质和细胞固定化技术可进行如抗体和酶这类生物分子的大量生产， 这使应用于生物诊断和生物解毒的新型传感器得到了发展。 这样的系统可以与微电子装置和终端电脑相连，从而在很多生物工程工业与服务业领域进行精密的程序控制。生物工程有两个典型的特点： 与实际应用的联系和各学科间
11、的合作。从事生物工程的人员采用的技术来源于化学、微生物学、遗传学、生物化学、化学工程和电脑原理。 他们的主要任务是对生物工程进行革新、发展并对过程操作进行优化， 其中生化代谢体制有着根本和不可取代的位置。 生物工程不是一门新的学科，而是一种实践活动，不同学科的专家学者们都将做出奉献。我们对生命科学与生物工程必须清楚的区分开， 生命科学所涉及的是生物知识的获得， 而生物工程则是生物知识的应用。生物工程过程在大多数情况下是低温下操作，耗能少，总体上依赖廉价的原料为底物。不同专业的生命学家和工程师将个人的努力奉献于生物工程， 生物工程学家这一术语作为涵盖那些应用自身技能知识进行生物材料处理的科学家或
12、工程师。然而，这个术语它只能导致混淆，必须停止采用 。我们比较一下，一名生化工程师是一名过程工程师， 他的职责是将生物学家的知识转移到生产实际操作中去。 一名生化工程师应当在生物过程的设计和操作方面受过科学和工程原理的训练。一个完美的生物工程师是不存在的，因为没有一个人同时成为微生物学、生物化学、分子生物学、化学工程等专业的专家。然而，从事这方面工作的人员必须努力去学习了解其他组成学科的语言， 不同专业的科学家之间共同语言的缺乏势必会成为完全发挥生物工程潜在价值的主要阻力。1.3 生物工程的应用生物工程过程可在其规模和价值的基础上进行评估。因此，大规模、低价值的产品或服务包括有水的净化、废水和
13、垃圾处理及甲烷、乙醇、菌体和动物饲料的生产；相对大容量、高价值的中间体产品包括氨基酸与有机酸、食品、面包酵母、丙酮、丁酮和某些多聚物，然而那些小规模、价值高的产品包括抗生素、干扰素、疫苗、单克隆抗体、酶和维生素。从工业发展规模角度进行考虑， 而不是单个生产单元大小的角度，现在和未来的生物工程可简单的分为三个领域：（a） 小规模生物工程是专指那些只利用生物学方法就可比较经济的进行生化产品的生产，这类生物工程发展时间久，并且发展迅速，尤其是新产品领域方面， 但他们造成了工业企业与市场发展的严酷竞争。 其产品有抗生素、单克隆抗体和干扰素。（b） 中等规模的生物工程与基于石油的技术竞争生产目前的化学原
14、料同时与农业竞争，生产天然产品包括蛋白质和脂肪酸。（c） 大规模的生物工程与石油和煤竞争， 提供主要的有化合物原料作为燃料和大量的工业产品。尽管中等和大规模的生物工程技术目前只取得了很小部分的经济效益， 但可以确定的是在未来的 20 年里，将要建立利用植物原料作为原料的大规模微生物处理工程图 1.2 。针对该类产品的市场已存在，同时也刺激了节约型生物工程的发展。1.4 生物工程的发展未来生物工程的发展在很大程度上取决于以下三个前提：（a） 利用传统工艺与基因工程技术体系，扩大对有价值产品的生产范围。（b） 从再生资源获得粗原料的能力。（c） 要意识到， 很多情况下生物工程的处理过程比现有的化学
15、工程处理植物原料更加经济。中等规模与大规模生物工程发展的一个最重要的方面是过程中， 适宜原材料与底物的利用率。原料成本可以占到终产物成本的 30-70%。原料的利用受技术与政治因素的影响。因此， 从各种有机原料中生产酒精汽油未能带来可观的经济效益。但从政治角度，可以议价以抵抗不断增长的石油进口。来自农业、 林业和工业有机废料的再生资源越来越重要， 经过生物工程处理，为食品、畜牧饲料、化学原料试剂的生产提供了政治策略上的重要基础。然而，为了实现这样的目标，不仅需要扩大生物工程项目，而且国家管理方面的项目范围也要扩大。1.5 生物工程的发展策略蓝图每个生物工程方案都一直需要对可利用资源、 经济效益
16、与对环境的影响及操作和使用者的健康与安全性进行评价。生物工程如果能够正确地加以设计，就能够在自然资源、人类需求与环境间建立良好的平衡关系。对生物工程发展尤为重要的是， 适宜的训练有素的工作队伍的可利用性。必须认识到， 生物工程出发点是在校的所有学生，经过有选择的进行技术等级水平培训， 就可培养出一支工业与研究中心需要的专家。没有合适的和经过充分培训的人员， 生物工程将无法发挥其潜在价值，特别是只有拥有经过良好培训的工作队伍，高水平的生物工程才能顺利开展。而且， 当我们考虑将生物学发现应用于未来工业发展的时候，不能忽略时间的重要性。从一个新的发现到成功生产出商业产品，这中间经过5-20 年的时间
17、。因此新的生物技术可望到 90 年代才能有较大的发展。这些不是试图描述或分析目前生物工程实践中不同的处理过程， 而是试图去证实围绕着基本原理的生物技术的核心部分已经得到了发展。1.6 总结生物工程是将生物体和过程处理应用于制造工业的技术。 生物工程涵盖的学科范围广泛，尽管今天，它的实际操作非常复杂，但是许多新的处理过程已经记载在历史的新篇章中。这种特殊的处理过程是经过微生物、 植物或动物细胞，或者是它们自身的产物如酶进行催化反应的。生物工程的生物体可被收集，它们可实现化学改造，可作为生物活性分子如酶和单克隆抗体的来源。基因工程技术开辟了应用遗传学的新领域， 并未最新工业处理过程的使用创造了时机
18、。例如，利用细菌细胞生产人干扰素。过程控制工程于发酵工程也取得了重要的进展，这将进一步加快生物工业的发展。生物工程就如一个不断扩张和充满机遇的领域， 它涉及了许多产业，包括农业、食品与饲料加工业、医药业 、能源与水处理工业。生物工程在新药、激素、疫苗和抗体生产方面， 提供廉价可靠的能源以及 从长远来看 在化学饲料方面、环境控制体系的改良提高与废物管理方面都将扮演重要的角色。 生物工程主要以可再生与可回收资源为基础，由于能源愈来愈贵并且供给不足，从而它将更好的满足世界的需求。第二章第二章 生长与代谢的生物化学生长与代谢的生物化学2.1 前言一个微生物以生产另一个微生物为目的。 在某些情况下，利用
19、微生物的生物学家们希望这样的情况能够快速频繁的发生。 在另外一些产物不是生物体自身的情况下，生物学家必须对它进行操纵使微生物的目标发生变化，这样以来，微生物就要努力的挣脱对它们繁殖能力的限制，生产出生物学家希望得到的产物。生物体的生长过程及其生产出的各种产物与微生物代谢的本质特点是密不可分的。代谢过程是两种互相紧密联系又以相反方向进行的活动过程。 合成代谢过程主要是细胞物质的生成，不仅包括构成细胞的主要组成物质蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物等等 ，同时也包括它们的前提物质氨基酸、嘌呤与嘧啶、脂肪酸、各种糖与糖苷。合成代谢不是自发进行的，必须由能量所推动 ，对大多数微生物来说，是通过一系列的产能
20、分解代谢过程来供给能量。碳水化合物分解为 CO2和水的过程是最为常见的分解代谢反应，然而微生物以这样的方式还能够利用更大范围的复原性含碳化合物。 分解代谢与合成代谢所有微生物生物化学的基础，可以从两者的平衡关系或者分别对它们进行讨论。实际中， 我们要有效的区分那些需要空气中的氧进行需氧代谢的生物与那些进行厌氧代谢的生物。复原性含碳化合物与 O2反应生成水和 CO2，这是一个高效的放热反应过程。因此， 一个进行需氧代谢的生物要使用一小部分底物进行分解代谢以维持某一水平的合成代谢，即成长过程。对于厌氧型生物，其底物的转化的过程基本上是一个不匀称的反应氧化复原反应 ，产生很少的能量，因此，大部分底物
21、都要被分解从而维持一定水平的合成代谢。在生物体中这种差异能够明显的表达出来， 比方酵母， 它属于兼性厌氧生物，即它可在有氧条件下生长也可在无氧环境下生存。 需氧酵母使糖以同样的速度转化为 CO2和水，相对产生高产量的新酵母。而厌氧条件下，酵母菌生长缓慢，此时酵母被有效的转化为酒精和 CO2。2.2 代谢与能量分解代谢与合成代谢间的有效联系在于， 各种分解代谢过程促进少量反应物的合成，而后又被用来促进全面的合成代谢反应。在这种重要的中间产物中，其中最为重要的是 ATP，其含有生物学家所说的“高能键”。在 ATP分子中，酐与焦磷酸残基相联。 高能键在水解过程中所产生的热量就被用来克服在其形成过程中
22、需要摄入的能量。像 ATP这类分子，为细胞提供了流通能量，当将 ATP用于生物合成反应时，其水解产物为 ADP腺苷二磷酸或者某些时候为 AMP腺苷一磷酸 ： 反应式仍含有一个高能键的 ADP 通过腺苷酸激酶反应也可生成 ATP： 反应式 。磷酸化作用是生物体中普遍的反应，通常由 ATP作用而发生。经过磷酸化生成的物质通常比最初的化合物更具有反应活性， 用无机磷酸进行磷酸化反应是无法进行的， 因为， 平衡反应式的相反方向生成大量的水 55M 。细胞的“能量状态”认为是由占有优势的组分：ATP、ADP、AMP 作用形成的。为了给出一个量值，Daniel Atksirson提出了“能荷”这个概念，定
23、义一个细胞的能荷为：ATP+0.5 ADPATP+ ADP+AMP在“满荷”细胞中，仅含有 ATP一种腺嘌呤核苷酸，它的能荷值定义为 1.0。如果三种核苷酸的量相等，即 ATP=ADP=AMP，则细胞的能荷为 0.5。与所有的习惯用法相同， 能荷概念的使用是有限制的，没有人能够确定假设一个细胞的能荷是 0.7 而不是 0.8 或者 0.6 到底是什么意思。这个概念没有考虑细胞中核苷酸确实切数量， 也没有说明对于单体酶和 ATP与其镁复合物之间的显著差异。它也无法解释细菌、酵母菌与霉菌中能荷值的差异。 尽管如此，这个概念对于给定的细胞类型如生长期细胞中随后的能量与酶活性的改变来讲是有所帮助的。当
24、细胞迅速生长时，能荷处于最低值；ATP以它重新合成的最快速度被消耗， 在生长末期， 生长速度开始变慢， 相对于ADP和AMP，ATP 组分开始增大，因此，能荷值开始增大，当细胞停止生长时，所有的 ADP和 AMP 都已经转化为 ATP，此时能荷值到达最大。2.3 分解代谢途径尽管微生物可以利用不同的含碳化合物进行生长， 但我们主要关心的是葡萄糖的代谢，鉴于乙醇和其它C2化合物 、烃和脂肪酸、甲烷和甲醇这些物质的不断增长的重要的经济价值。2.3.1 葡萄糖和其它糖几乎在所有的生命细胞中， 最重要的两种糖代谢途径是二磷酸己糖途径与一磷酸己糖途径，它们常常同时发生，为合成代谢过程提供重要的联系，它们
25、之间的相互作用受关键控制机制的支配。二磷酸己糖途径 常被称为恩伯纳-迈耶霍夫或者糖酵解途径 如图 2.2 所示。这个过程将葡萄糖转化为丙酮酸，碳原子数量无变化，复原2 分子 NAD+辅酶生成 2 分子 ATP。 生成的丙酮酸是合成代谢重要的前提物质的来源， 在好氧有机体中，它还是氧化复原反应的底物，而在厌氧有机体中，丙酮酸或者它转化的产物是 NADH 的氧化剂。一磷酸己糖途径即磷酸戊糖途径如图 2.4。作为氧化过程，它将葡萄糖转化为戊糖和CO2， 复原2分子NADP+生成NADPH。 NAD+ NADP+和NADH/NADPH都是通过 H 转移而作用，但它们是有差异的；NADH 主要在于能量相
26、关的氧化复原反应中发挥作用，而 NADPH 主要作用于合成代谢过程中的复原反应步骤。经过一系列可逆互变过程，如图 2.4 所示，磷酸戊糖与其它含有 3-7 个碳原子的磷酸糖相平衡，并根据环境条件，扮演不同的代谢角色。磷酸丙糖与糖酵解过程中所生成的相同，而且跳过糖酵解途径的cleavage step 生成二磷酸己糖；磷酸丁糖是重要的合成代谢生产芳香环氨基酸的前体， 而磷酸戊糖也是合成核苷酸所必需的物质。对大多数有机体而言，66-80%的葡萄糖是经过恩伯纳-迈耶霍夫途径进行代谢的， 剩下的则通过磷酸戊糖途径进行代谢。每个代谢途径中碳原子流向的控制点通常是恩伯纳-迈耶霍夫途径中，当 6-磷酸果糖被磷
27、酸果糖激酶PFK催化发生磷酸化作用生成 1，6-二磷酸果糖时候。这种酶分子组成可以根据细胞所进行的主要代谢情况而对酶活性进行调节： 当需要更多能量的时候， PFK 的活性就增大；而如果细胞中有足够的能量或者足够的C3代谢产物，则PFK 的活性就降低。这种通过调节催化活性从而对酶进行控制的原则是很普遍。 代谢途径是一直被控制的，对细胞来说，必须协调并最有效的行使它的整体活动。对于 PFK 的控制通过两种手段。第一，酶的激活。在存在有ATP或 ADP 时，酶催化反应的速度被增大。因此，当细胞能荷低时，PFK 将以高速率催化反应地进行。第二，酶被中间产物一般为磷酸烯醇式丙酮酸或者柠檬酸抑制，从而代谢
28、过程被减缓。因此， 如果它们其中的一种不能被有效转化为其它物质的话，就无法使细胞继续进行生长。葡萄糖代谢的其他可控制点根据有机体的不同而不同。 但是分解代谢必须尽可能的满足合成代谢的需求。恩伯纳-迈耶霍夫途径与磷酸戊糖循环途径不是葡萄糖仅有的代谢过程，尽管它们是非常普遍的代谢途径。相对于恩伯纳-迈耶霍夫途径，另一种主要的代谢途径是恩特纳道德洛夫途径，见于某些假单孢菌与细菌中，如图 2.5 所示。磷酸戊糖途径中的酶对 C5和 C4糖的产生来说仍是必需的，但代谢方向与图 2.4中所示的相反。磷酸酮醇酶是另一种较重要的酶， 也许比人们一般上了解到的使用范围更加广泛。这类酶不是一个作用于磷酸C5和 C
29、6糖，产生乙酰磷酸和3-磷酸甘油醛或者 4-磷酸赤藓糖取决于是 C5还是 C6糖被利用如图 2.6。这些酶最早见于进行异型发酵的乳酸杆菌与醋酸杆菌中，它们取代恩伯纳 -迈耶霍夫途径而发挥作用。产生的乙酰磷酸可以被转化为乙酰或者乙醇。最近发现在酵母菌中，当大多数酵母以木糖作为单一碳源进行好氧生长时，磷酸酮醇酶是一种诱导酶。木糖经过最初代谢由木糖醇转化为木酮糖， 然后以 5-磷酸木酮糖进行磷酸酮醇酶反应，如图 2.6 所示在以利用木糖进行生长的细菌中，有一种异构酶可直接将木糖转化为木酮糖 。 在这种情况下， C5-磷酸酮醇酶不取代恩伯纳-迈耶霍夫途径而仅仅是为有机体将戊糖转化为C2或者C3单元进行
30、进一步代谢提供一种有效的途径。 这类酶从而存在于很多微生物中而不单单是酵母，当利用木糖或其它戊糖进行生长代谢。2.3.2 三羧酸循环目前所讨论的代谢途径其终产物为 C3或者 C2化合物， 称为丙酮酸酯或者乙酰， 前者如乙酰 CoA 是一种硫酯如图 2.7 ，具有酐的反应性脱氢反应活性 。丙酮酸酯与乙酰 CoA 的进一步有氧代谢经过一个循环过程，具有两种作用。它产生的中间产物用来进行生物合成反应，化合物最终被氧化为 CO2和水，它将氧化反应与能量转移相联系。乙酰 CoA 氧化反应循环过程普遍存在于所有好氧细胞中被称为三羧酸循环，克雷布斯循环 。在真核生物细胞中， 三羧酸循环与产生能量的反应是在线
31、粒体内完成的，而在细菌体内， 产生能量的酶位于细胞质膜上。由于线粒体内的代谢过程首先七十于将丙酮酸转运到线粒体中，从而更容易的使丙酮酸进行三羧酸循环反应。丙酮酸转化为乙酰 CoA 的整个过程是由一种多酶复合物所催化的，丙酮酸脱氢酶。乙酰 CoA 接下来通过图 2.8 所示的三羧酸循环反应而代谢。这个循环的作用包括：（i）生产可用于其它生物合成途径的中间产物例如：天冬氨酸与谷氨酸反应是非常重要的代谢途径，细胞通过该途径同化氨。（ii）从氧化反应中回收能量。异柠檬酸脱氢酶、 -酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶这些酶催化中间产物的进一步氧化反应，同时辅酶有氧化型转为复原型。 辅酶I NAD
32、+ 和 FAD分别转变为 NADH和 FADH.，然后又经氧化磷酸化作用重新氧化为最初形式的辅酶，每摩尔 NADH 产生 3 摩尔 ATP，而摩尔 FADH2产生 2 摩尔 ATP。琥珀酸激酶反应也可获得能量。尽管这种循环自身是永不停止的， 一旦从草酰乙酸启动将不断进行下去，但实际上这种情况是不存在的。就像已经说明的那样，这个循环同时为生物合成反应储备中间产物，一旦任何一种中间产物从循环中被除去，草酰乙酸与柠檬酸的合成就无法进行。因此，额外的草酰乙酸就必须独立自主的合成，这主要通过丙酮酸的羧化作用。这个反应由丙酮酸羧化酶催化， 但是由于经过循环反应过程也合成了草酰乙酸，因此，必须对丙酮酸的羧化
33、反应进行调控，以使得乙酰 CoA 于草酰乙酸的含量保持均等，主要通过丙酮酸羧化酶实现对它的控制。乙酰 CoA 是丙酮酸羧化酶的正效应物，也就是说它可以提高酶的活性。乙酰 CoA 含量越高，草酰乙酸的合成速度就越快。当草酰乙酸与乙酰CoA 合成了柠檬酸，乙酰CoA 的浓度就减少；丙酮酸羧化酶的活性随之下降，但由于丙酮酸脱氢酶仍旧存在，将会产生更多的乙酰 CoA。这样，柠檬酸合成不仅不会停止，这两个物质也使柠檬酸的前提物质始终保持平衡。其它辅助控制也能实现对循环过程的调节，其中的有些酶的活性受 ATP 抑制， 而有些则受到 AMP 浓度的影响。 因此， 循环反应过程可以通过 ATP与 AMP相应的
34、比例来进行调控，也就是细胞的能荷。这种控制机制没有广泛采用，但对于单个有机体或一群有机体是被证实的，在这里不详细讨论，但控制机制的普遍原则如对糖酵解过程的控制仍被应用。2.3.3 乙醛酸途径以 C2化合物为碳源如果一个有机体利用 C2化合物或者脂肪酸或烃进行生长，那么产物主要为C2单元，三羧酸循环不能完全满足有机体的生长代谢，像前面内容中所讲过的，任何用来进行合成代谢的化合物，一旦在三羧酸循环中缺少，那么草酰乙酸的生成便会停止，由于 C2化合物不能转化为丙酮酸丙酮酸脱氢酶的反应是不可逆反应 ，因此，没有一种途径可将草酰乙酸或者更准确地说是任何一种 C4化合物通过目前已经所述的反应由 C2化合物
35、合成。如果被作为碳源而利用，乙酰 CoA 可直接由乙酰生成，或者来源于复原性比乙酰更强的 C2化合物，如乙醛或者乙醇。通过已知的乙醛酸途径如图 2.9，乙酰转化为 C4化合物，这个过程需要用到在三羧酸循环中作用的酶：异柠檬酸裂解酶与苹果酸合成酶。两种酶都是可被诱导的，当微生物利用 C2化合物生长代谢；在这样的生长条件下，酶的活性可提高到 20-50 倍。乙醛酸途径不会取代三羧酸循环；例如：必须合成 -酮戊二酸用来为蛋白质的合成提供谷氨酸等。琥珀酸、柠檬酸裂解酶的另一个产物，同以前代谢生产的产物一样为苹果酸，然后是草酰乙酸。因此， 经过乙醛酸循环，C4化合物就由 C2单元进行合成，然后用来合成所
36、有的细胞代谢物。它们转化为糖的过程在 2.4 部分中详细介绍。2.3.4 脂肪酸和烃利用烃进行生长的情况并不多见，但却见于细菌、酵母和霉菌中，这种利用脂肪酸或油和脂肪这种含有脂肪酸的物质进行代谢的现象是比较常见的。烃类可作为生产单细胞蛋白的唯一碳源， 也可用于其它代谢过程，如柠檬酸的生产。常在抗生素生产中加入脂肪酸和植物油作为辅料。为了利用油和脂肪，有机体必须用脂肪酶水解细胞内或细胞外酯键，而生成 3 摩尔游离脂肪酸和1 墨尔甘油；甘油在恩伯纳迈耶霍夫途径中被利用，很多微生物也可利用游离脂肪酸，但无论这类酸是被摄入到细胞内还是就此形成，它们都是剧毒性的由于它们具有外表活性剂的性质从而必须立刻转
37、化为其辅酶 A 的硫酯形式。硫酯又经过如图 2.10 的循环过程活化，用来降解脂肪链。每轮循环，都将产生 1 摩尔乙酰 CoA，与此同时，其链上少了 2 个碳原子的酯酰基 CoA 又开始了新一轮的氧化循环。 这个过程即为 -氧化循环， 它将一直持续到反应终产物为C4化合物，乙酰乙酰 CoA，此时产生 2 摩尔的乙酰 CoA。如果脂肪酸含有的碳原子数为奇数，那么该降解过程不断延续直到生成丙酸 CoA，它将通过 2.7.3 部分中所讲反应的可逆反应转化为丙酮酸。微生物利用烷烃进行生长通常由攻击两个甲基基团中的一个而开始， 利用这种攻击机制， 烷烃羟化酶包含氧分子和含铁的氧化辅因子，这个辅因子是经氧
38、化的，而它的复原型重新生成过程最终与氢化物载体相关，或者是 NADH 或者是NADPH。经过两部脱氢作用，脂肪醇被氧化为相应的脂肪酸： 反应式一般来说，所有的参与烷烃降解作用的酶都具有底物专一性，而且容易与C10-C18的底物起作用。某些微生物可作用于更短或更长的链。少数情况下，对烷烃作用后生成甲基酮，它最终经过进一步氧化被裂解为甲酸和比初始烷烃少 2个碳原子的脂肪酸。尽管在某些有机体中，存在一种产生二羧酸的 -氧化，但烷烃一般上都是经过 -氧化循环而被降解为脂肪酸，这些脂肪酸又从一个终点开始，经过 -氧化而降解。脂肪酸也被细胞用来直接合成自身脂肪，因此，细胞中脂肪酸链的长度就代表了烷烃链的长
39、度。烷烃和某些支链烃也可能进行代谢； 它们不是从商业角度进行利用而是作为饲料中的微小部分。它们的氧化反应过程同样涉及转化为脂肪酸的过程。2.3.5 甲烷和甲醇少数 细菌和酵母 被称为甲基营养菌的微生物能够利用甲醇作为唯一的碳源；到目前为止，只发现一小部分细菌具有利用甲烷的能力，称为甲烷营养菌。极少数微生物能利用甲酸为碳源。这三种化合物的代谢是相关的，被最终氧化为CO2，它们合成细胞物质的机制与自养 CO2固定化作用机制是不同的。能够利用 CO2作为唯一碳源的包括进行光合作用的植物与微生物和很少一部分无机化能营养型细菌，其是利用无机化合物的反应作为能量的来源。这些生物目前在生物工程中的应用较少。
40、假设想进一步了解 CO2自养固定化的读者可参阅任何一本生物化学课本，但必须注意到，至少有两种不同的代谢途径：卡尔文循环和复原性羧酸循环。甲烷的氧化过程为： 反应式第一步是通过一种氧合酶与 NADH或 NADPH辅因子来进行， 与上述高级烷烃的氧化相比较 。氧合酶3 种蛋白质复合物也可以氧化其它多种化合物，包括多种烷烃甚至甲醇本身。接下来的第二步反应由甲醇脱氢酶催化， 以一种新发现的物质吡咯并喹啉醌为辅因子。在某些细菌中， 甲醛进一步转化为甲酸的过程被同种酶催化；而在另一些细菌中，有一种独立作用的甲酸脱氢酶，NAD 是它的辅因子。最后一步反应是将甲酸转化为 CO2，它是通过甲酸脱氢酶来催化进行的
41、，伴有 NAD+的复原过程。来自甲醇或甲烷中的碳同化为细胞物质甲醛， 经过两种独立的代谢途径：一磷酸核酮糖循环和丝氨酸途径，分别如图 2.11 和 2.12 所示。单磷酸核酮糖循环与卡尔文循环相似，都是通过磷酸戊糖途径的反应进行CO2自养固定化而生成以后的 C1化合物受体，只多了两种酶：磷酸己糖合成酶和 3-磷酸己糖异构酶。丝氨酸途径中的关键酶是：生成乙酰 CoA 和甘油的苹果酰 CoA 以及丝氨酸转甲基酶，这是一种广泛存在的酶，作用于四氢叶酸四氢叶酸是一种辅因子，可形成必需的活化 C1中间产物，N10-甲酰四氢叶酸，而后乙醛酸途径利用乙酰CoA。所以细胞就可在 C2底物上进行生长。异柠檬酸裂
42、解酶去阻遏从而确保 C3单元的生成。酵母中， 磷酸戊糖循环又进一步发生了一些变化， 甲醛与 5-磷酸木酮糖反应生成了 3-磷酸甘油醛和 2-羟基丙酮。此反应过程由转酮酶催化，完成甲醛循化同化过程唯一需要另外加入的酶是一种新的激酶， 它将二羟基丙酮转化为二羟基磷酸丙酮。2.4 葡糖异生作用当一个有机体利用 C2和 C3化合物进行生长， 或者利用经过代谢过程能够生成 C2或 C3这种化合物的物质进行生长的时候， 在丙酮酸的代谢水平或者低于该水平例如脂肪烃、乙酸、乙醇或者乳酸 ，对有机体来说，就必须合成各种糖类以满足其代谢需求。这被称为葡糖异生作用。尽管糖酵解途径中的大部分反应都是可逆的， 但那些被
43、丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶催化地反应则是不可逆的，对细胞来说，就要避开这种阻碍。一般而言， 磷酸烯醇式丙酮酸不能由丙酮酸形成，尽管在少数有机体内存在一种磷酸烯醇式丙酮酸合成酶可以催化这个反应。通常，草酰乙酸作为磷酸烯醇式丙酮酸的前体物质。这个反应由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化进行， 它是葡糖异生作用中的关键酶。 已经讲过草酰乙酸的生成，果糖二磷酸化酶的作用可避开磷酸果糖激酶的不可逆作用的性质其作用产生 1，6-二磷酸果糖 。从这一点来看， 通过终止糖酵解途径可积累己糖，通过磷酸戊糖循环又可生成 C3和 C4糖，葡萄糖不是葡糖异生作用的终产物， 然而 6-磷酸葡萄糖被用来合成细胞壁组分，和各种细胞外
44、物质及储备多糖。2.5好氧生物的能量代谢在葡萄糖代谢和三羧酸循环中已经讲过，如何把各种代谢中间产物的氧化过程与辅因子NAD+、NADP+、FAD+复原为其复原型NADH、NADPH、FADH的复原反应过程联系起来的。这些产物的复原性是由一系列复杂的反应过程而是释放。 这个反应过程最终与空气中氧气的复原相关。 在这个反应过程中，由电子传递上的 ATP 或者 2-3 个具体位点上的无机磷而生成 ATP，这取决于最初复原剂的性质。如图 2.14，总反应式如下： 。 。 。 。 。 。 。每摩尔葡萄糖经过恩伯纳-迈耶霍夫途径所生成的 ATP 和丙酮酸经三羧酸循环产生的 ATP总结于表 2.1。能够被生
45、物利用的 ATP形式的能量是在膜上产生的，可以是真核细胞的线粒体膜或者是细菌细胞的细胞质膜，其产生过程大致相同。具体差异根据个体差异而不同。电子传递链的主要成分是黄素蛋白，醌和细胞色素。细胞色素具有复原性接受氢离子或者电子 ，经过氧化可以有效释放电子到下一个载体上。每个载体都有不同的氧化 -复原能，大约可以从 NADH/NAD+反应的 320 摩尔到1/2O2/H2O 终反应的 800mV。在电子传递链上的特定位点，两个相邻电子载体的氧化-复原能差就已足够进行可逆反应： 。 。 。 。向合成 ATP的方向进行。这个过程需要一种复杂的多亚基酶 ATPase的协助。有两种原理来说明 ATPase是
46、怎样作用的。 在化学渗透学说中， 过去二十年里米歇尔对其进行了发展，认为电子传递上的各组分是跨膜排列的，由于质子从一边向另一边移动，这样便产生了pH 和电子浓度梯度。质子跨膜运动就推动了ATPase反应合成 ATP。ATPase是定向作用的，质子只能从一边靠近催化位点，图 2.15 对这个概念进行了简单说明。ATP 合成的第二种解释为，电子传递链上的载体与假设的将要被活化的中间产物相互作用使 ATP磷酸化。这种中间产物称为偶联因子。两种理论个具有优缺点，都可以解释不成对氧化磷酸化作用产生的影响，如鱼藤酮、安必妥、抗霉素 A 等。它们可以阻止 ATP的合成。2.6 厌氧生物能量生成过程在 2.5
47、 部分中所说的 ATP生成过程需要供给氧气。 某些有机体则可以用磷酸盐，另一些则用硫酸盐或铁离子来代替氧气分子，而且如果在培养集中，这些物质被大量供给，那么有机体利用电子传递体在没有空气的条件下仍可以生成ATP，从而进行厌氧生长。如果没有合适的电子受体，或者如大多数细菌有机体缺少这类物质，那么一旦缺少氧气，有机体将不能以这样的方式合成 ATP。所以，进行厌氧生长的有机体就必须将 ATP 合成反应与能量生成反应相联系，才能获得 ATP，这被称为底物水平磷酸化。这只发生在有限数量的反应中。反应自由能的变化必须能够进行ATP磷酸化反应。 其中最为重要的反应归纳于表2.2。这 6 种反应，其中后 3
48、种只对少数生物体来说是重要的。表 2.2 中其它的 3个反应中， 反应 1 与反应 2 涉及糖酵解的中间产物，涉及乙酰磷酸的反应 3 广泛存在于厌氧有机体中。乙酰磷酸由乙酰 CoA 与无机磷反应而合成，它还是被磷酸酮醇酶作用的。乙酰 CoA 可以由乙酰乙酰 CoA 降解而生成， 或者由丙酮酸经 3 种反应中的一种而生成：丙酮酸脱氢酶反应，丙酮酸甲酸裂解酶反应，铁氧还蛋白氧化复原酶反应， 该反应与丙酮酸脱氢酶反应产生同样的产物， 但是用到了一种铁硫蛋白，铁氧还蛋白不是 NAD+作为复原剂复原型铁氧还蛋白被氢化酶复原为铁氧蛋白，释放出氢气这三种酶中，后两种对氧敏感，当含有它们的有机体被暴露于空气中
49、的时候，它们便会迅速失活。越来越多的证据说明，电子传递磷酸化同样可以进行延胡羧酸复原酶的反应。 这种酶对于某些产甲烷菌，复原硫酸盐的有机体及进行氢气与二氧化碳发酵的氢化菌来说大概是重要的。反应： 。 。 。 。 。 ，氢原子可以由各种辅因子提供，包括NADPH，而某些有机体如大肠杆菌、其氢原子的生成经过了电子传递链，即使与好氧有机体中的电子传递链不同，但也至少是类似的。因此，尽管没有氧气，有机体仍通过偶联不同的反应从而生成 ATP。所有的厌氧有机体都面临两个问题：第一，在氧化磷酸化作用中，缺少将NADH 或 NADPH 的再氧化与 ATP的生成相联系。每摩尔底物所生成的 ATP量比好氧代谢产生
50、的少。第二，不能将 NADH 的氧化与氧气的复原相联系，这样如何进行这个重要的反应就成为一个问题，当所有的NAD+不可逆的转化为NADH，代谢过程也就很快被停止。厌氧生物采用很多方法使复原型辅因子重新被氧化。 其中的核心部分为： 。 。 。这里，由AH2A 这步是厌氧生物利用底物时所采用的途径中的一部分。通常，底物B 是补充复原反应所必需的，也直接来源于底物； BH2一旦形成，就不再进一步代谢。 AH2的代谢与 BH2的补偿性生成在化学计量上相关。 这样以来，厌氧生物必须积累复原型代谢产物从而能够进行任何底物的降解过程。而且， 就像已经说明的那样， 既然厌氧生物从降解底物后获得极少的 ATP，