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1、基因表达谱分析技术1 微阵列技术（ microarray）这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。其原理基本是利用光导化学合成、 照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术, 在固相表面合成成千上万个寡核苷酸“探针”（cDNA 、 ESTs 或基因特异的寡核苷酸），并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA 或 mRNA 反转录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。其优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达进行对比分析。包括cDNA
2、芯片（ cDNA microarray ）和 DNA芯片（ DNA chips ） 。cDNA芯片使用的载体可以是尼龙膜 ，也可以是 玻片 。当使用尼龙膜时，目前的技术水平可以将 20000 份材料点在一张12cm18cm的膜上。尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了的双链 cDNA片段。 要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。杂交的结果表示这一样品中基因的表达模式，而比较两份不同样品的杂交结果就可以得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。杂交使用的探针一般为mRNA的反转录产物，标记探针使用32PdATP 。如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。杂交时使用两种不同颜色
3、的荧光标记不同的两份样品，然后将两份样品混合起来与一张芯片杂交。洗去未杂交的探针以后，能够结合标记cDNA的点受到激发后会发出荧光。通过扫描装置可以检测各个点发出荧光的强度。对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品中的丰度。一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。使用尼龙膜为载体制作cDNA芯片进行研究的费用要比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。检测两种不同的组织或相同组织在不同条件下基因表达的差异， 只需要使用少量的尼龙膜。但是利用玻片制作的cDNA芯片灵敏度更高，而且可以使用 2种探针同时
4、与芯片杂交，从而降低了因为杂交操作带来的差异；缺点是无法重复使用还必须使用更为复杂的仪器。Guo等（2004）将包含 104 个重组子的cDNA文库点在芯片上，用于检测拟南芥叶片衰老时的基因表达模式，得到大约6200 差异表达的ESTs，对应 2491 个非重复基因。其中有134 个基因编码转录因子，182 个基因预测参与信号传导，如MAPK 级联传导路径。 Li 等（2006）设计高密度的寡核苷酸tiling microarray方法，检测籼稻全基因组转录表达情况。芯片上包含13,078,888个 36-mer 寡核苷酸探针，基于籼稻全基因组shot-gun测序的序列合成，大约81.9%（3
5、5,970 ）的基因发生转录事件。Hu等（ 2006）用含有 60,000 寡核苷酸探针（代表水稻全部预测表达基因）的芯片检测抗旱转基因植株（过量表达SNAC1 水稻）中基因的表达情况，揭示大量的逆境相关基因都是上升表达的。2 基因表达系列分析（Serial analysis of gene expression, SAGE）基因表达系列分析（SAGE ）是一种转录物水平上研究细胞或组织基因表达模式的快速、有效的技术，也是一种高通量的功能基因组研究方法，它可以同时将不同基因的表达情况进行量化研究（ Velculescu et al., 1995） 。 SAGE的基本原理是：每一条mRNA 序列
6、都可以用它包含的 9bp 的小片段（TAG ） 代替，因此考查这些TAGs出现的频率就能知道每一种mRNA 的丰度。首先利用生物素标记的oligo （dT）引物将mRNA 反转录成双链cDNA ，然后利用NlaIII酶切双链 cDNA 。NlaIII酶的识别位点只有4bp，因此 cDNA都被切成几十bp 的小片段。带有生物素标记的小片段cDNA被分离出来，平均分成2 份。这 2 份 cDNA分别跟 2 个接头连接， 2 个接头中均有一个FokI 酶切位点。 FokI 是一种 II S型核酸内切酶，其识别位点不对称，切割位点位于识别位点下游9bp 且不依赖于特异的DNA序列。 FokI 酶切分成
7、2 份的 cDNA之后，名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - 带有部分接头序列的TAGs就被释放下来。这时将2 份 cDNA混合起来，进行连接反应。根据接头序列设计引物扩增连接反应的产物，然后通过NlaIII酶切 PCR产物得到连接在一起的两个 TAG ，即 ditag 。将 ditags串连起来， 克隆到质粒载体中。一般每个克隆包含50 个左右的ditags 。这些克隆经过PCR扩增然后测序。 因为每一个ditag之
8、间都是以NlaIII识别位点间隔的，所以很容易对每个的ditag进行区分和计数。 而每一个TAG在 SAGE 库中出现的频率就代表了该基因的表达水平。利用SAGE可以在短期内得到丰富的表达信息，与直接测定cDNA克隆序列方法相比，减少了大量的重复测序，从而大大节省了研究时间和费用。这种方法对正常、癌基因旁、癌组织中基因的差异表达研究方面还有独到的优点，有助于发现肿瘤特异基因。首次运用SAGE 技术是分析1000 个胰腺基因的表达情况（Velculescu et al., 1995） ，结果都显示它是一种有效的功能基因组研究方法。最早用SAGE技术进行研究的高等植物是水稻（Matsumura e
9、t al., 1999） 。 运用 SAGE 技术检测了水稻中来源于6000 个基因 10000 个 TAGs 。SAGE分析显示绝大部分高表达基因都是看家基因，这些基因的mRNA 在总 RNA中的比例超过1。在无氧处理和对照的幼苗中分析了2000 个左右的TAGs ，结果显示多数基因的表达没有变化。有趣的是，发酵途径相关的基因同样没被检测到。根据TAG序列设计引物，成功扩增出了延伸因子EF-1a 0.2kb 的 cDNA片段。 这一事实说明利用9bp 的 TAG序列和 4bp 的 NlaIII识别位点序列，可以设计引物用于长片段cDNA的获得。3 cDNA-AFLP cDNA-AFLP 是从
10、基因组AFLP方法 （Vos et al., 1995） 发展来的 RNA 指纹技术。经典的 cDNA-AFLP按照标准的AFLP方法进行操作， 只不过模板变成了cDNA 。 这一方法包含3 个步骤：a. 将 cDNA酶切并连上载体；b. 利用包含选择性碱基的引物进行扩增；c. 电泳及成像。一般选择两种限制性内切酶进行cDNA的消化， 这两种酶一种的酶切位点为4 个碱基， 另一种为 6 个碱基。 在植物基因组的AFLP操作中， 需要添加3 个进行选择性扩增。因为 cDNA的复杂性比基因组低，所以cDNA-AFLP 中每个引物只需要2 个选择性碱基。聚丙烯酰胺凝胶电泳中，最大的cDNA-AFLP
11、 产物为1000bp 左右，最小将近100bp。对马铃薯的已知cDNA序列分析发现，cDNA-AFLP中常用的两种酶只能同时切割大约45的 cDNA 。如果使用这种方法，几乎一半的基因的表达情况是无法被揭示出来的，因此对 cDNA-AFLP方法进行了修改， 在 cDNA的酶切时仅仅采用单酶切，这就是单酶切的cDNA-AFLP技术（Habu et al., 1997） 。1999 年，Kawamoto等人进一步发展了这项技术，他们称之为iAFLP 技术。利用该技术可以同时检测多个样本的基因表达差异。cDNA-AFLP技术在植物中的首次运用，是Bachem等（ 1996）对马铃薯基因表达差异的研究
12、。该研究分离到两个在马铃薯块茎形成过程中差异表达的cDNA片段。 这两个基因的转录都是块茎特异性的； 它们在 15 天的块茎中高度表达，但在其它组织中表达量很低。此后无论在分离抗逆相关基因的研究也有成功的报道（Ivashuta et al., 1999） 。4 差异展示PCR （ Differential Display Reverse Transcription PCR, DDRT-PCR）DDRT-PCR 是基于反转录和PCR的功能基因组研究方法，最早由 Liang 和 Pardee （1992） 报道。这种方法能有效地检测真核细胞中特定基因的表达模式，因而可以用于发现和克隆新的基因。DD
13、RT- PCR技术的基本原理是扩增反转录产物得到分子量大小不同的cDNA片段。首先利用oligo （dT）引物反转录mRNA 得到 cDNA ，然后利用相同的oligo （dT）引物和另一随机引物进行 PCR扩增。到目前为止该技术已经得到了大量的改进。为了提高特异性，可以增加随机引物的特异性。碱基数增加以后，有可能包含某一特异基因家族的保守序列，这使得检测某一类基因的表达情况成为现实。分离 DDRT-PCR 的产物简单易行， 可以通过变性或非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳（Liang et al., 1995） 、毛细管电泳（George et al., 1997）或普通琼脂糖电泳获得。 DDRT-
14、PCR 产物的标记， 可以使用 33PdATP（Simon and Oppenheimer, 1996） 、名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 荧光（ Jones et al., 1997）或银染（ Gottschlich et al., 1997） 。因为这种方法非常简便，所以它得到了广泛的应用。自从该方法被发明以来，已有许多成功的报道， 应用范围包括从微生物到人类的各个物种。在植物中运用DDRT-PCR 方法得到
15、了大量的 cDNA克隆，从拟南芥中得到了一些控制生物钟的基因（Kreps et al., 2000） ，从大麦野生型品种和无根毛的突变体中克隆了一个控制根毛形成的基因HvEXPB1 （Bratanich and Blanchetot, 2006） 。该技术在生物对逆境条件适应的研究中同样得到了广泛的应用，为了弄清楚在多系统衰竭综合症中猪圆环病毒型侵入时发生的细胞学事件，利用 DDRT-PCR 鉴定了一些淋巴细胞内受此病诱导而的靶分子，其中两个差异调节转录本显示与人的基因有一定同源性， 分别是 RNA剪接因子和透明质酸介导的运动受体（Kwasniewski and Szarejko, 2006）
16、 。5 抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization, SSH）SSH方法是一种简便而高效地寻找差异表达基因的新方法。该方法是以抑制PCR 为基础的 cDNA消减杂交方法。所谓抑制PCR ，是利用非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅柄”结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制非目标序列的扩增。SSH 方法既利用了消减杂交技术的消减富集，又利用抑制PCR进行了高效的复性动力学富集。其全部流程包括4 个主要步骤： a. 分别反转录tester和 driver的 mRNA 得到双链cDNA ，然后利用RsaI 酶切cDNA ，并将酶切的test
17、er cDNA加上接头。 b. 用大大过量的driver与 tester进行两轮杂交，对杂交产物进行抑制PCR扩增。 c. 将 PCR产物克隆进质粒载体，转化后挑取文库。d. 对 SSH文库进行筛选。抑制差减杂交法不仅能分离高丰度差异表达基因，而且能有效富集低丰度差异表达基因。1996年 Diatchenko等人构建了第一个SSH文库，并通过与人类Y染色体的Cosmid 文库杂交证实了该方法的有效性。运用该技术仅通过一轮反应既可使特异表达的基因富集1000 倍以上。 过去几十年来， 抑制差减杂交法广泛运用于动植物、微生物研究。 在植物中主要用于组织器官、发育阶段和逆境差异表达基因的筛选（Gep
18、stein et al., 2003; Chu et al., 2004; Zeng et al., 2006） 。 Gepstein 等 （2003） 利用该方法从拟南芥中得到了约800 个自然衰老相关的cDNA片段， Chu等（ 2004）使用该技术鉴定了702 个与 xa13 介导的抗病反应相关的ESTs。到目前为止， SSH方法得到了很多改进和完善。为了进一步消除SSH中的背景， Rebrikov等（2000）提出了基于MOS （Mirror orientation selection）的抑制消减杂交，有效的提高了筛选效率。 Zeng 等（ 2006）将 SSH和 cDNA Micro
19、array技术联合运用，从棉花中筛选到了242 个体细胞胚胎形成相关的cDNA片段，进一步证实了该方法的实用性。以上几种都是高通量筛选特异表达基因的方法，但是同时给我们带来大量重复或无意的数据。带来这一问题的一个原因是因为一种mRNA 能产生不止一个信号。我们构建的cDNA文库和制作的 cDNA芯片，都不可避免地会包含重复克隆。而如果我们使用单酶切cDNA-AFLP ，那么每一条 mRNA 都最终会形成不止一条条带（ Habu et al., 1997） 。 当然随着技术地改进，cDNA-AFLP中的冗余信息有可能被彻底除去（Matz et al., 1999） 。但是 DDRT-PCR 的特
20、点却决定了它一定会有重复数据。 因为每一条mRNA 通常都会跟不止一对引物结合，所以它会带来至少两条分子量大小不同的条带。另一个更重要的原因是只有少数的基因是真正差异表达的，而我们的检测到的差异很多只是背景。例如， 在拟南芥中利用cDNA芯片技术对673 个基因的分析发现，只有 2个基因真正在两种材料中差异表达（Kehoe et al., 1999） 。运用 SAGE方法对水稻幼苗 1500 个基因的分析显示， 仅有 24 个在无氧处理前后表达量有显著差异（Matsumura et al., 1999） 。到目前为止， 如何消除组成性表达基因造成的背景仍然是一个急待解决的难题。虽然消减杂交提供了一个消除背景的方法，但是效果仍不是十分理想。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -