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1、一、人员资质及培训要求 从事医疗器械微生物检验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。检验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认它们可以承担某一检验前，他们不能独立从事该项微生物检验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必须的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别试验人员的继续教育计划。 检验人员必须熟悉相关监测方法、程序、检验目的和结果评价。微生物实验室的管理者其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符，如：管理技能、实验室安全、检验安排、预算、实验研究、实验结果的评估和数据偏差的调查、技术报告书写等。 无菌室
2、环境控制设备微粒计数仪无菌室环境控制设备浮游菌采样仪无菌室环境控制设备洁净室沉降菌测试方法 1.测试时间 1.1对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。 1.2对非单向流，如10000级、100000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。 2.采样方法 将已制备好的培养皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。 2.2.培养 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。在3035培养箱中培养，时间不少于48h。每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3
3、只培养皿作对照培养。洁净室沉降菌测试方法 3.菌落计数用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用510倍放大镜检查，有否遗漏。若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。4.注意事项4.1测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。4.2采取一切措施防止人为对样本的污染。4.3对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。4.4由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。4.5采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除
4、。洁净室沉降菌测试方法 5.测试规则 5.1.测试状态 5.1.1沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。 5.1.2沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。 5.1.3测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。 5.2.测试人员 5.2.1测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。 5.2.2静态测试时，室内测试人员不得多于二人。最少采样点数目最少采样点数目同时满足最少平皿数采样点的布置 采样点的位置可以同悬浮粒子测试点。 a）工作区采样点的位置离地0.8m1.5m左右（略高于工作
5、面）。 b）可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。 采样点位置的详细规则见附录B（标准的附录）。 采样点布置 环 境 检 测 参 照 标 准微生物实验室管理严格区分污染区及清洁区相 关 标 准 GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准 GB 15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准 GB 15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法和标准三、灭菌控制 微生物实验使用的试剂、器材等常需用湿热灭菌法。湿热灭菌的温度和时间需验证，必须保证物品灭菌后无菌保证值SAL10-6。灭菌程序经验证合格后方可使用。定期进行BD实验、 真空泄漏测试、温度参数测试（空载热分布、定载热穿透
6、、满载热穿透）、压力改变速率测试（GB8599-2008大型蒸汽灭菌器技术要求），同时以生物指示剂验证灭菌效果, 必须保证物品灭菌后无菌保证值SAL小于百万分之一。 三、灭菌控制 所有器具应采用可靠方法灭菌 置压力蒸汽灭菌器内12130 min 或 置电热干燥箱内1802 h。 湿热灭菌控制相关标准 GB 18281.3-2000医疗保健产品灭菌 生物指示物 第3部分:湿热灭菌用生物指示物 ISO 11138-3-2006医疗保健产品灭菌.生物指示物.第3部分:湿热灭菌用生物指示剂四、培养基管理 1、培养基的制备 2、培养基的贮藏 3、培养基的质量控制实验 四、培养基管理 灵敏度检查 （中国药
7、典2010） 无菌检查（ISO11737.2:2009或GBT19973.2-2005）五、 无菌操作 定义：是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。 无菌操作技术主要包括两方面：创造无菌的培养环境及在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入。创造无菌的培养环境包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；防止一切其它微生物的侵入的措施包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。微生物实验前准备 微生物实验控制1：人
8、员管理 微生物实验控制2：环境控制 微生物实验控制3：灭菌控制 微生物实验控制4：培养基管理 微生物实验控制5：无菌操作微生物基本操作 琼脂平板接种法 琼脂斜面接种法 半固体接种法 肉汤培养基接种法 琼脂平板接种法 细菌在自然界及人体中分布广，种类多，为了了解菌谱，须先将各种细菌分离，获得纯菌培养物后才能进一步作细菌的鉴定。琼脂平板培养基因面积大，接种后可达到分离的目的，常称分离培养法。平板接种方法有多种。以下介绍平行划线法及分区划线法。 琼脂平板接种法（分离培养法）分区划线法琼脂平板接种法（分离培养法）平行划线法 琼脂平板接种法（分离培养法）单个菌落单个菌落琼脂斜面接种法 目的：多用于纯种细
9、菌的增菌和保存菌种 方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许。拔去琼脂斜面培养基塞，管口经火焰上灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上在琼脂上蜿蜒划线；接种后，管口在火焰上灭菌，塞回塞，接种环灭菌：在试管口处做好标记，置37培养1824小时 大肠杆菌斜面大肠杆菌斜面 金黄色葡萄球菌斜面金黄色葡萄球菌斜面肉汤接种法 目的：用于增菌。 方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许；以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上，然后将试管稍倾斜，使肉汤碰及细菌即可；接种后管口灭菌，塞回塞，接种环灭菌，并做好标记，置37培养18-24小时 半固体接种法（穿刺接种法） 目的：增菌和保
10、存菌种；观察细菌有无动力。 方法：用接种针，将取有细菌的接种针自培养基中央刺入（不要接触管底），沿原穿刺线拨出，注意在刺入与拔出时不可晃动接种针；接种后做好标记。置37培养18-24小时半固体琼脂培养基（半固体琼脂培养基（0.5%） 菌悬液制备（使用麦氏比浊管） 麦氏比浊管：是McFarland发明的一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管。具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的，有表可查，这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度不同，且都有定值。麦氏比浊管的配比麦氏比浊管的配比菌悬液制备（使用麦氏比浊管） 【材料】 1、实验所需的微生物新鲜培养物如：金黄色葡萄球菌新鲜培养物； 2、无菌生理盐
11、水、麦氏比浊管； 3、酒精灯、接种环、无菌吸管、平皿。菌悬液制备（使用麦氏比浊管） 【方法】 1、轻摇标准试管； 2、无菌操作挑取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至无菌生理盐水试管（与标准管相同直径）中混匀，直到浊度与所要求的标准管的浓度相同； 3、序列稀释已挑取菌落的生理盐水试管至所需的菌液浓度如：100cfu/ml; 4、用平皿计数法验证所配置菌液的实际浓度。菌悬液制备（使用麦氏比浊管） 【使用技巧】 1、直接用眼睛看（需要经验，误差较大）。 2、找张白纸打上平行直线，利用光在不同浓度液体折射不同帮助观察比较。麦 氏 1 号 管 稀 释 梯 度 表（cfu/ml）菌悬液制备（使用分光光度仪 ）分光
12、光度仪 菌悬液制备的保存 菌悬液制备：菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在28的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在28，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。 培养基质量控制：灵敏度检查 灵敏度检查所需的六种菌： 金黄色葡萄球菌 CMCC (B)26003 ATCC 6538 铜绿假单胞菌 CMCC (B)10104 ATCC 9027 枯草芽孢杆菌CMCC (B)63501 ATCC 6633 生孢梭菌CMCC(B)64941 ATCC 11437 白色念珠菌CMCC(F)98001 ATCC 10231 黑曲霉CMCC(F)98003 ATCC 16
13、404 根据培养基的功能选择灵敏度实验所需菌种根据培养基的功能选择灵敏度实验所需菌种 中国药典2005年版 明确规定： 培养基灵敏度、微生物限度检查法检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。培养基质量控制：灵敏度检查 中国药典2010年版在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种有了较为明确的规定： 允许使用标准菌株和商业派生菌株 标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活 标准储备菌株应进行纯度和特性确认 标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法 标准储备菌株可用于制备每月
14、或每周一次转种的工作菌株 冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用 工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株培养基质量控制：灵敏度检查菌株传代基本概念 标准菌株：标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。（0代） 标准储备菌株：标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。（1代） 商业派生菌株：商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。（2代） 工作菌株：工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。（2代） 代：代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称
15、为一代。采购的第2代超低温冷冻标准储备菌种储备菌种工作菌种第3代工作菌种第3代工作菌种第4代工作菌种第4代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代制备工作菌种进行菌种保藏的模式图各类菌种保藏条件及时间菌 种培 养 基保存温度传 种 时 间细 菌一般多用于营养琼脂或根据菌种规定选用培养基46芽孢杆菌36个月，其它细菌每个月酵母菌一般用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母膏琼脂46一般46个月丝状真菌一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等46每4个月移植一次（每2个月移植一次）菌 种 保 管 菌种保管应有专人负责，保存与加锁的冰箱菌种保管应有专人负责，保存与加锁的冰箱中或特制的白铁箱中加锁置阴
16、暗处，确保菌种安中或特制的白铁箱中加锁置阴暗处，确保菌种安全。因工作变动时，必须做好交接工作。全。因工作变动时，必须做好交接工作。 菌种应有详细登记本，包括名称、分离日期、菌种应有详细登记本，包括名称、分离日期、鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能，并注意记录鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能，并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。使用、转移及销毁情况和原因。 各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移种种3次后作一次全面鉴定。注意菌种有无污染和次后作一次全面鉴定。注意菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时更换。变异，如发现污染和变异时，应及时更换。 购置菌种，
17、应有介绍信。购置菌种，应有介绍信。全部保存菌种应具备全部保存菌种应具备清单，并定期向部门负责人报告。清单，并定期向部门负责人报告。 FTM 的 灵 敏 度 检 查培养基质量控制：灵敏度检查接种金黄色葡萄球菌、緑脓杆菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，3035培养1824h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐液体培养基中，3035培养1824h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，2328培养2448h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10
18、-100cfu/ml菌液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，2328培养57d,加35ml0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml孢子悬液备用。 培养基质量控制：灵敏度检查培养基质量控制：无菌检查 每批灭菌的培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14天，应无菌生长。 无菌实验无菌实验预防假阳性措施 1在一个专门准备、环境控制的房间内的层流罩的环境中进行测试 2在整个测试过程中使用无菌技术 3用避免污染的方法把测试器皿、培养基和测试物品引入测试区 4测试产品表面的细菌污染，在引导测试物品进入测试区之前，
19、先对产品的外包装进行消毒。 5对测试中使用的设备、材料和产品进行灭菌 6简化进行测试必须的操作 7尽量避免悬浮微粒的产生 8环境时时监测（沉降菌检测）无菌实验相关标准 GBT19973.2-2005-医用器材的灭菌 微生物学方法 第二部分：确认灭菌过程的无菌试验 ISO 11737-2 2009-医用器材的灭菌 微生物学方法 第二部分：确认灭菌过程的无菌试验无菌实验：培养条件 不论哪种无菌试验方法：FTM32.52.5，不少于14天；SCDB22.52.5，不少于14天； 改良马丁23-28，不少于14天。 如果14以内观察到阳性结果，不必继续培养。无菌实验阳性对照 应根据供试品特性选择阳性对
20、照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗霉菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。加菌量小于l00cfu，供试品用量同供试品无菌实验时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养4872小时应生长良好 阴性对照 阴性对照：阴性对照供试品无菌实验时，应取相应溶剂和稀释同法操作作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。无菌实验：结果判断 肉汤培养基有菌生长的常见三种形式： 混浊生长：液体变混浊。 菌膜：液体澄清，表面有一薄层菌膜。 沉淀生长：液体澄清，管底有沉淀物 混浊生长：液体变混浊肉汤培养基有菌生长
21、的常见形式无菌实验：结果判断 1.阳性对照管应生长良好，阴性对照管应无菌生长 2.培养期间逐日观察并记录是否有菌生长，如培养14天后，培养基出现浑浊，但不能确定是否有微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基或划线接种于斜面培养基上，细菌培养两天，霉菌培养三天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。 释出物检查无菌实验验证：释出物检查 目的：对未知或可疑的供试品，在进行无菌试验实验前进行方法验证试验，以确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。无菌实验验证：释出物检查 取灭菌产品以无菌操作转移到培养基中,30
22、-35培养24hrs ； 注意：使用与实际无菌实验同种等量的培养基 接种每毫升浓度小于100cfu的菌种稀释液在无菌培养基内，一式两份，其中一份加入无菌试样，另一份作为阳性对照，并在合适的温度培养不超过5天。按表1所列菌种重复以上步骤。实验组对照组释 出 物 检 查在合适的温度培养不超过5天。选择合适的微生物，重复以上步骤。释出物检查 解释：通过与阳性对照对比，如果在培养容器内看不到微生物生长，则说明使用的样品能抑止细菌或霉菌的生长。可以考虑使用无菌中和剂，如吐温80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、-内酰胺酶。如果中和剂无效，增加培养基的量。尽量使用能使试验微生物生长的最小的培养基的量。释出物检查常
23、用菌种初始污染菌定 义 生物负载 ：一件产品和/ 或包装上存活的微生物总数。 生物负载估计值 ：通过对活菌计数或灭菌前活菌计数加上一个回收效率补偿系数， 得出的组成生物负载的微生物数值 。初始污染菌相关标准 GBT19973.1-2005-医用器材的灭菌 微生物学方法 第一部分产品上微生物总数的估计 ISO-11737-1:2006 GBT19973.1-2005-医用器材的灭菌 微生物学方法 第一部分产品上微生物总数的估计样品份额取样原则样品份额取样原则 1 定义：样品份额 (SIP) sample item portion，即从某一保健产品单元上取出的用于试验的部分。 2取样注意事项 2.
24、1若可操作，试验应使用整个产品单元。但这往往被认为是不可行的，产品单元上的样品份额宜在实验室易于操作的前提下尽可能大。 2.2如果所用的样品份额( (SIP) 小于一个完整的产品单元，则应选择代表产品单元的具有微生物的部分。如果已验证微生物在产品单元上是均匀分布的，应从产品单元上任一部位选择样品份额。在缺少这些验证的情况下，应从产品单元上随机选择几个部分作为样品份额。 2.3样品份额本身应对产品单元内的产品有代表性。当产品分成不同的部分，可以分装于两个或多个容器内。样品份额可以根据供试产品单元的长度、质量、体积或表面积。如果产品单元有标签说明只是液路无菌，宜把液路视为整个试验单位。(即SIP=
25、1 ) 2.4 SIP选择举例，见表1表1 SIP 选择举例表1 SIP 选择举例 校正因子校正因子 定义：用于对活菌计数或灭菌前活菌计数进行修正的数值，以补偿产品上无法完全洗脱的微生物，以便计算出生物负载估计值。 校正因子反复洗脱方法实验步骤 1取样品1件或sip，投入一定量的无菌洗脱液中(A)。 2样品的处理采用旋涡混台器(2800次min)，振荡2min。 3注皿：取处理洗脱液A2ml，分别注入两个无菌平皿中，每平皿1ml。 4再洗脱:将样品从洗脱液A中取出沥干，移入另一定量的无菌洗脱液中(B)。 5再处理:将B洗脱液置旋涡混台器(2800次min)振荡2min。 6再注皿:取B洗脱液2
26、ml，分别注入两个无菌平皿内，每平皿lml。 注：当微生物数少时,从B洗脱液开始，即可用无菌滤膜过滤后直接放培养基中培养。 7如此反复洗脱4次即A、B、C和D，直至洗脱累积量(初始污染菌)不再增加，最后沥干样品，将其平铺于无菌平皿中(E)。然后将熔化并冷至4548的NA培养基，分别注入AE各平皿每皿15ml。 8待凝固后，放置在规定的培养条件下(3035，48h82h)培养，进行活菌计数。 校正因子=1/0.3825=2.61 校 正 因 子 计 算校 正 因 子 计 算 同批产品，需抽取3-5件，进行重复性试验，确定最小、最大及平均回收率和初始污染菌数。 根据校正因子，灭菌前初始污染计数乘以
27、校正因子即为产品带菌总数。初始污染菌方法验证 检验洗脱液有无抑菌作用 检验样品有无抑菌作用1.试验组3.样品对照组初始污染菌方法验证（药典）在3次独立的平行试验中: 洗脱液对照组(4)的菌回收率应均不低于70%。（4/2）100 试验组(1)的菌回收率应均不低于70% （1-3）/2100 2.菌液组4.洗脱液对照组初始污染菌方法验证（ISO11737） 选用灭菌产品，如果洗脱技术中用到洗脱液，每一产品都应经受常规微生物洗脱技术，则将一定数量的易受破坏的微生物放人洗脱液中，回收微生物。 选用灭菌产品，如果产品直接放人培养基中，可以参照无菌实验的抑菌实验进行。 常规洗脱回收细菌数1 实验组2 对
28、照组实验组回收细菌数/对照组菌数10070初始污染菌方法验证（ISO11737）微生物实验实验前实验中实验后环境控制培养基质量灭菌控制人员控制无菌操作方法验证灵敏度实验无菌检查无菌实验初始污染菌B/F验证洗脱液验证样品无抑菌作用仪器校正沉降菌检测简化操作 物体表面细菌总数物体表面细菌总数 方法：将内径为5cm5cm的灭菌规格板，放在被检物件体表面，根据物体表面积大小，采平行样l4个，用浸有灭菌生理盐水的棉拭子，在规格板内涂抹10次（往返计为1次），将棉拭子放入l0ml灭菌生理盐水的采样管中。 物体表面细菌总数 将每个采样管震打80次，混匀，10倍递减稀释，每个稀释度（取3个稀释度）分别取1ml
29、放于灭菌培养皿（每个稀释度倾注2块平板），用普通琼脂培养基作倾注培养，置37温箱培养24h,观察结果，取菌落数为30300的培养皿计算，求出平均菌落数。 菌数（cfu）/cm2=平均菌数稀释倍数/采样面积（cm2） 生产人员手细菌总数 生产人员手细菌总数 方法：被检人五指并拢，将浸有灭菌生理盐水的棉拭子在右手指曲面，从指尖、甲沟至指根处往返涂抹10次后，将棉拭子放入10ml灭菌生理盐水的试管中。 生产人员手细菌总数 将每个采样管震打80次，混匀，10倍递减稀释，每个稀释度（取3个稀释度）分别取1ml放于灭菌培养皿（每个稀释度倾注2块平板），用普通琼脂培养基作倾注培养，置37温箱培养24h,观察
30、结果，取菌落数为30300的培养皿计算，求出平均菌落数。 菌落数（cfu）/每只手=平均菌数稀释倍数 平皿计数法计数原则 1.先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。 2.首先选择平均菌落数在30300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为细菌总数(见例1)。 3.若有两个稀释度的平均菌落数均在30300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数(见例2及例3)。平皿计数法计数原则 4.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数(见表1，例4)。5.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数(见表1，例5)。6.若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数(见表1，例6)。 7.若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告(见表1，例7)。稀释度选择及菌落总数报告方式101 结束语结束语