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1、紫外吸收法和Bradford法检测蛋白质浓度 Still waters run deep.流静水深流静水深,人静心深人静心深 Where there is life, there is hope。有生命必有希望。有生命必有希望一、紫外吸收法一、紫外吸收法 1、原理：原理： 蛋白质分子中含有共轭双键，在蛋白质分子中含有共轭双键，在280nm处有处有最大吸收值，其吸光度与蛋白浓度成正比。以标最大吸收值，其吸光度与蛋白浓度成正比。以标准蛋白作参比即可求得未知蛋白浓度。准蛋白作参比即可求得未知蛋白浓度。 2、器材与试剂器材与试剂（1）、器材 A.紫外分光光度计 B.坐标纸 C.恒温水浴 D.微量加样器
2、 E.移液管 F.试管与试管架（2）、试剂）、试剂A. 9 g/L NaCl 溶液溶液B. 标准牛血清白蛋白溶液标准牛血清白蛋白溶液 牛血清白蛋白牛血清白蛋白0.1克加生理盐水定容克加生理盐水定容 至至 100毫升。毫升。C. 待测血清样品待测血清样品1 取血清取血清0.1毫升，用生理盐水稀释毫升，用生理盐水稀释 至至 2.0毫升。毫升。3、操作、操作取3支试管按下表操作： 空白 标准 测定 标准蛋白标准蛋白 （1 mg/ml） 0 1.0 0 待测样品待测样品1 （ml） 0 0 1.0 生理盐水生理盐水 (ml) 4.0 3.0 3.0 轻轻混匀放置5分钟，在nm处以空白调零，测定各管光密
3、度，计算蛋白含量 计算公式：计算公式： 测定测定O.D/标准标准O.D X 标准浓度标准浓度X稀释倍数稀释倍数 =待测样品蛋白浓度（待测样品蛋白浓度（mg/ml) 也可也可 分别测定各管分别测定各管280nm处的处的O.D值，值，以蛋白浓度以蛋白浓度为横坐标，以为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲线。值为纵坐标绘制标准曲线。 根据未知蛋白的根据未知蛋白的O.D 值，可在标准曲线上查出该蛋值，可在标准曲线上查出该蛋白的浓度。白的浓度。v280nm/260nm吸收差法：吸收差法： v 由于核酸在260nm处有吸收峰，同时测定280nm和260nm的光度值，然后计算出蛋白浓度。依生理盐水调零点，
4、用经验公式计算蛋白浓度（简便但精确度稍差） v 1.450 x0.D2800.745X0.D260 =蛋白浓度（蛋白浓度（mg/ml） 二二、Bradford法(一）、原理：原理： 考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。 该方法快速、准确、干扰因素少。CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulf
5、ate），Triton X100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。v（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）氯化钠溶液（生理盐水）v（3）标准蛋白质溶液（标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）： 精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理生理盐水盐水定容至100毫升。 (4) 血清样品(已稀释200倍) (5) 层析样品(前次层析实验分离的原液)(三）、操作操作（标准曲线制作）（标准曲线制作） ：取7支试管按下表操作： 空白 待测标1 标2 标3 标4 标5标准蛋白标准蛋白 （ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0待测样品待测样品2（ml） 0.2 生理盐水生理盐水（ml） 1.0 0.8 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0CBB-G250(ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 最终蛋白浓度（微克/毫升） 3.3 6.6 9.9 13.2 16.5 混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以以蛋白浓度为横坐标，以O.D值为纵坐标绘制标准曲值为纵坐标绘制标准曲线线v以以Bradford法测定血清和层析分离法测定血清和层析分离蛋白内的蛋白浓度蛋白内的蛋白浓度 取取2支试管分别从支试管分别从血清样品血清样品和和层析样品层析样品中中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入