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1、研究目的 探讨分子生物学研究中肿瘤库的建库条件，标本的采集、保存和质量控制，以及肿瘤库的信息化管理等有关问题，创建肿瘤组织标本库，保护和合理利用肿瘤的标本资源，为临床和科学研究人员，提供合适数量的肿瘤标本促进肿瘤的研究。理论基础三、组织储存北京大学季加孚等研究发现：手术后1 h内取材的组织经过3年低温保存，90以上的标本仍有清晰的28S和18S RNA条带，提示RNA完整性较好4DNA分子稳定性较mRNA好，在-80环境中保存5年，DNA完整性良好54.季加孚北京大学临床肿瘤学院肿瘤标本库的建设J北京大学学报：医学版，2005，37(3)：329330 5.张佳年， 于颖彦， 计骏.等. 低温
2、冻存时间对肿瘤组织生物大分子的影响J. 诊断学理论与实践 2009，V018，No1材料与方法肿瘤组织库库房，放置液氮罐、冰箱、冰柜等冷冻设备，用于存放标本；分子生物室（中心实验室）用于提取血清、血浆、分离淋巴细胞。库房设备：液氮罐1个（YDS-30，沈阳新光）， -80立式超低温保存箱2台（DW-86L628，青岛海尔），4-20冰柜1台（BCD-130Eb，青岛海尔）；联想电脑、条码扫描器、条码打印机1套（BP-IP300，德国BRADY）等。库房生物样本库资源信息管理系统主要设备BRADY条码打印机液氮罐海尔-80冰箱患者入院后行生物安全性检查。检测HIV以及嗜肝病毒HBV及HCV感染情
3、况。HIV感染患者不列为采集对象。HBV及HCV感染者需在标本上明确注明。尊重患者的知情权和隐私权，在向患者及家属介绍标本采集和使用目的，获得患者自愿签署知情同意书后，方可安排标本采集和数据录入。组织采集手术结束后，标本离体30分钟内完成，在临床肿瘤专家的指导下，在不影响病理诊断取材需要的前提下，采集组织样本。1）标本取材部位：肿瘤组织、癌旁组织（癌组织旁1cm）和正常组织（癌组织旁5cm及以外或最远处）。2）过程：使用数码相机拍摄标本外观后，将标本切成小块（直径0.50.5cm，厚度0.5cm），为减少处理时间，标本不应切得太小，然后放入无菌冻存管内，做好标记，记录标本采集的时间及标本的类型
4、。每例病人样本保存35份冻存管标本。每份组织重量原则不低于2g。3）标本冻存管标记后直接冻存于液氮中，后转移至-80冰箱中。标本运送过程中，将其置于冰中保存。 术前血：指临床诊断明确，患者未经任何治疗，即放疗、化疗及免疫治疗等，已接受上述治疗的患者样本需详细注明。术后血：指接受手术后2周，患者未接受任何放疗、化疗或免疫治疗等。1、取血液标本，每例采集10ml（不少于5ml），约10ml全血平均分装于红帽管（不含抗凝剂，1管）和紫帽管（含2%EDTA抗凝剂，2管）中。2、红帽管用于分离血清，室温放置30分钟后离心；紫帽管用于分离血浆及淋巴细胞。3、1500r/min离心10分钟，此时悬液分层，上
5、层淡黄色为血清（红帽管）或血浆（紫帽管），底层为红细胞，紫帽管中中层呈灰白色的为外周血淋巴细胞。4、轻轻吸取淡黄色上层血清（血浆）放入1.5ml离心管中，每管200l，共12管（血清6管，血浆6管），做好标记。5、新鲜抗凝血（含2%EDTA抗凝）去血浆后，按照1:1比例加入PBS液混匀。6、15ml离心管内先加入3ml淋巴细胞分离液，后加入6ml稀释样品，注意加入样品要缓慢进行，不要冲破液面，影响离心效果。202下2000r/min离心20分钟。7、离心后血样分四层，将移液管插入液面，轻吸灰白色的淋巴细胞层，放入另一15ml离心管中，注意吸取过程中避免吸入分层液和血浆。8、按1:5的比例向淋巴
6、细胞中加入PBS液，混匀洗涤，室温1000r/min离心10min。9、弃去上清液保留底部沉淀，适用1.5mlPBS液吹打洗涤，置入标记好的1.5ml细胞冻存管中，高速离心机500r/min离心5分钟。10、弃去上清液保留底部沉淀，血清、血浆及淋巴细胞分装完毕后贴好二维标签。质量控制样本DNA完整性检测方法一：提取样本基因组DNA，检测OD260/OD280值。进行0.7%琼脂糖凝胶电泳。通过DNA电泳判断组织标本的基因组是否完整。无基因组DNA或DNA出现明显降解为不可用样本。方法二：通过PCR选择扩增管家基因，如GAPD、HHPRT、-actin，分析扩增产物的含量。产物含量相对较少或无产
7、物，可判断为不可使用标本。质量控制样本RNA完整性检测方法一：参照Trizol 试剂盒操作指南进行组织总RNA 的提取。应用紫外分光光度计测260 nm、280 nm OD值定量分析RNA（OD 260/OD 280为1.7-2.0）；1%琼脂糖凝胶电泳后观察5 S、18 S和28 S条带情况。28 S和18 S条带亮度的比值约2:1，表明标本中的RNA完整性较好。出现降解者为不可用样本。方法二：RT-PCR扩增-actin、HHPRT管家基因，分析扩增产物的含量，产物含量相对较少或无产物可判断为不可用样本。方法三：Northern Blot检测-actin、HHPRT管家基因，无印记者列为不
8、可使用样本。蛋白质完整性检测蛋白质完整性通过Western Blot进行检测，检查标本样本中-actin的蛋白表达量变化，通过分析印记条带，判断蛋白量是否有变化，无条带或条带变弱者为发生组织降解样本。结果自2010年7月建库以来共收集保存了各类肿瘤（胃癌、结肠癌、直肠癌、甲状腺癌、胃肠道间质瘤等）患者的组织标本1333例，胃癌患者424例，直肠癌267例，结肠癌246例，甲状腺肿瘤254例，胃肠道间质瘤45例，其他类型肿瘤97例。标本总量11919份，其中包括肿瘤组织1170份，肿瘤旁组织900份，正常组织1113份，血清3923份，血浆3931份，淋巴细胞843份，粪便39份。已向外省提供6
9、0份患者血淋巴细胞样本，用于DNA相关研究，效果良好。随机抽取近1年的组织样本20例，用Trizol试剂提取组织总RNA，测量各标本的OD260/OD280比值均在1.8-2.0之间。1%琼脂糖凝胶电泳后，28 S和18 S条带清晰明亮，5 S条带很弱，且28 S和18 S条带亮度的比值约为2:1，表明标本中的RNA完整性较好。 讨论我科室有稳定的肿瘤标本来源，以保证库存标本在数量上不断补充。 目前我科室肿瘤标本库标本的收集、保存 及信息的采集，技术路线已经基本成熟和规范，本肿瘤库可为肿瘤的基础和临床研究提供可靠的标本来源。组织库运行中的细节、大量组织标本的质量控制以及如何合理利用现有的标本资源，是我们需要进一步完善解决的问题。谢谢！