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1、一一.怎样定义怎样定义miRNA(成熟成熟)1, 长度为22nt的转录体.可通过northern blot等方法检测得到.2,其前体为典型的发卡结构.miRNA位于发卡结构的茎部分.3, 通过Dicer酶的处理后生成.4,序列具有高度的保守性.二二.miRNA.miRNA的生成过程的生成过程注意事项注意事项: 1,通过RNA聚合酶II转录生成.具有mRNA的结构特征 2,可以是多顺反子结构.即一条pri-miRNA包含多个成熟 miRNA的信息. 3,在判断一非编码蛋白质的mRNA是否生成miRNA时,我们可以通过抑制Drosha的活性,观察pri-miRNA的含量是否增加.4,miRNA可来
2、源于外显子,也可来源于内含子和非编码序列.5.miRNA在基因组DNA上成族分布,处于同一族的miRNA常共表达三三. miRNA. miRNA的作用机制及功能的作用机制及功能 作用机制作用机制:与靶基因mRNA 3-非翻译区通过不完全配对结合降低mRNA稳定性或抑制靶基因的 翻译.此外, miRNA也可与5-非翻译区和编码区序列结合调节靶基因的表达. 有文献报道,miRNA可与mRNA3-非翻译区的其他部位结合,升高mRNA的稳定性.注意事项注意事项: 1, 由于miRNA与靶序列是通过不完全配对结合,因此证实miRNA的靶基因成为一难点. 2,一种miRNA常有多个靶基因.功能功能:miR
3、NA 主要通过抑制它的靶基因来起调控作用。miRNA 的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的过程。 Lewis 等人的预测结果发现，预测的 miRNA 的靶基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因。虽然 miRNA 的作用也是特异的，特别是5端的28个碱基，特异性的靶向与它的靶基因，但是与 siRNA 不同的是 miRNA 的特异性并不是那么强，在生物体内往往一个 miRNA 作用于多个靶基因 6. 对于同一家族miRNA,其功能常具有互补作用.比如: 在MYC诱导的B细胞淋巴瘤小鼠模型中,剔除miR-17-92族DNA序列可诱导凋亡,如果导入此族中的任意一种miRNA均可减轻细
4、胞凋亡.7. 不同miRNA可同时调节同一靶mRNA1.miRNA与细胞增殖与细胞增殖apoptosis转录因子转录因子p53miR-34aStress(H2O2,UV等)Proinflammatory cytokine转录因子转录因子NF-kBmiR-146(1) IL-1 receptor- associated kinase 1 (2) TNF receptor- associated factor 6抑制cytokine signaling2.miRNA与细胞凋亡与细胞凋亡3.miRNA与细胞信号传导与细胞信号传导四四.microRNA.microRNA表达的特点表达的特点1,1,时间
5、特异性时间特异性在高等生物,microRNA的表达在生长发育的不同阶段是不同的.2,2,组织特异性组织特异性在不同的组织中, microRNA的表达不同的四四.寻找寻找miRNA基因基因 1. Forward genetics2. MiRNA cloning3.Computational approaches to miRNA discovery五五. .检测检测miRNAmiRNA表达的方法表达的方法 1, Northern 杂交 2, Real-time RT-PCR 3. 基因芯片的方法六怎样预测六怎样预测miRNAmiRNA的靶基因的靶基因第一种方法第一种方法: 过表达或抑制miRNA
6、的表达,利用基因芯片筛选出差异表达基因.从这些差异表达的基因中,证实miRNA的靶基因.注意事项注意事项: 1.并非所有的差异表达基因都是并非所有的差异表达基因都是miRNA的靶基因的靶基因.许多差异基因表达的改变是由靶基因表达的改变而引起.miRNA转录因子p53P53的靶基因P53的靶基因不是该miRNA的靶基因2.该方法不能证实该方法不能证实miRNA所有的靶基因所有的靶基因.根据miRNA与靶基因mRNA 3UTR的配对程度不同, miRNA可降解靶基因mRNA(配对程度高),也可不降解靶基因mRNA (配对程度低) 但抑制mRNA的翻译,第二种方法第二种方法: 由生物信息学预测miR
7、NA的靶基因.预测miRNA靶基因的网站: http:/www.microrna.org/mammalian/index.html. http:/pictar.bio.nyu.edu/ http:/www.microrna.org/microrna/home.do http:/www.targetscan.org/注意事项注意事项: 根据背景知识, 选择两个或两个以上网站均有预测的靶基因做进一步分析七怎样证实七怎样证实miRNAmiRNA的靶基因的靶基因5UTR3UTRORFAAAAAAAAA靶基因靶基因mRNAPCR扩增扩增3UTR克隆克隆3UTR到报告基因到报告基因luciferase下游
8、下游luciferase3UTR报告载体报告载体将重组载体转染细胞将重组载体转染细胞,观察过表达或抑制观察过表达或抑制miRNA后后,luciferase活性是否改变活性是否改变.为进一步证实为进一步证实miRNA确实调节该靶基因确实调节该靶基因,还需完成以还需完成以下实验下实验1,突变突变3UTR上与上与miRNA结合序列结合序列(主主要是种子序列要是种子序列),观察观察突变后的突变后的3UTR可否可否废除废除miRNA对对luciferase活性的影活性的影响响2,观察过表达或观察过表达或抑制抑制miRNA后后,内内源性靶基因源性靶基因mRNA和蛋白质和蛋白质水平是否相应改水平是否相应改变
9、变.3,miRNA与靶基因与靶基因功能相关性的研究功能相关性的研究八八.miRNA表达调控与肿瘤表达调控与肿瘤miRNA在基因组DNA上拷贝数的改变(扩增,转位和缺失) 比如: (1) 在B-CLL中, miR-15a/16-1族区域DNA出现缺失. (2) 在淋巴瘤细胞中, miR-17-92族区域DNA出现扩增. 在胶质细胞瘤中, miR-26a出现扩增 (3) 在T-ALL中, miR-17-92出现转位.2. miRNA合成的影响3. miRNA的转录调控(1)转录因子对miRNA的调节作用.(2)DNA甲基化对miRNA的调节作用.比如: miR-136,-431,-432,-433.1. (3)表观遗传对miRNA的调节作用.4.miRNA与肿瘤的转移比如: miR-10b,miR-9,miR-31 and miR-335与乳腺癌的转移有关5. miRNA与肿瘤的诊断谢谢大家谢谢大家!