《生物制药》酶类药物.解读.ppt

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1、 超氧化物歧化酶是一种重要的氧自由基清除剂，超氧化物歧化酶是一种重要的氧自由基清除剂，作为药用酶在美国、德国、澳大利亚等国已有作为药用酶在美国、德国、澳大利亚等国已有产品。由于产品。由于SOD能专一性去除超氧阴离子自能专一性去除超氧阴离子自由基，故引起国内外生化界和医药界的极大关由基，故引起国内外生化界和医药界的极大关注。注。 目前临床上应用集中在自身免疫性疾病上如类目前临床上应用集中在自身免疫性疾病上如类风湿关节炎，红斑性狼疮，皮肌炎等风湿关节炎，红斑性狼疮，皮肌炎等三、超氧化物歧化酶三、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD） 稳定性稳定性 对热稳定：天然牛血对

2、热稳定：天然牛血SOD可可75加热数加热数分钟，对热稳定性与溶液离子强度有关分钟，对热稳定性与溶液离子强度有关 对对pH的稳定性：一般的稳定性：一般pH5.39.5较稳定，较稳定，猪血猪血SOD在在pH7.69较稳定较稳定。 吸收光谱吸收光谱1.SOD的性质的性质结构特点：结构特点：金属酶金属酶Fe-SOD: Mw38000，2个亚基，每个亚基含个亚基，每个亚基含1个个Fe，存在，存在 于于 中中 Cu、Zn-SOD: Mw32000，2个亚基，每个亚基含个亚基，每个亚基含1个个Cu，1个个 Zn，存在于，存在于 中中Mn-SOD: 原核细胞中，原核细胞中，Mw40000,2个亚基，每个亚基个

3、亚基，每个亚基1个个Mn 真核细胞中，真核细胞中，Mw80000，4个亚基，每个亚基个亚基，每个亚基1个个Mn真核细胞真核细胞原核细原核细胞胞 金属辅基与酶活性关系金属辅基与酶活性关系 Cu、Zn-SOD：Zn与分子结构有关，与与分子结构有关，与催化活性无关催化活性无关;Cu与活性有关，对酶活力与活性有关，对酶活力是必需的是必需的 Mn-SOD：Mn对酶活力是必需的对酶活力是必需的 Fe-SOD：Fe对酶活力是必需的对酶活力是必需的2.生产工艺生产工艺 分离纯化分离纯化SOD常根据原料，种类和性常根据原料，种类和性质的差异而有所不同。质的差异而有所不同。（1）以牛血红细胞提取）以牛血红细胞提取

4、Cu、Zn-SOD的工艺的工艺（2）工艺过程：）工艺过程：1）收集、浮选）收集、浮选 取新鲜牛血，离心除去血浆。取新鲜牛血，离心除去血浆。2）溶血、去血红蛋白：干净红细胞加水溶血）溶血、去血红蛋白：干净红细胞加水溶血30min，然后加入然后加入0.25倍体积的乙醇和倍体积的乙醇和0.15倍体积的氯仿，倍体积的氯仿，搅拌搅拌15min，离心去血红蛋白，收集上清液。，离心去血红蛋白，收集上清液。3）沉淀、热变性：将上述清液加入）沉淀、热变性：将上述清液加入1.21.5倍体倍体积的丙酮，产生大量絮状的沉淀，离心得沉淀物。积的丙酮，产生大量絮状的沉淀，离心得沉淀物。再将沉淀物加适量水，离心去不溶物，上

5、清液于再将沉淀物加适量水，离心去不溶物，上清液于6070热处理热处理10分钟，离心去沉淀得浅绿色得分钟，离心去沉淀得浅绿色得澄清液。澄清液。 4）柱层析、洗脱、超滤浓缩：将上述澄清液超）柱层析、洗脱、超滤浓缩：将上述澄清液超滤浓缩后小心加到已用滤浓缩后小心加到已用2.5mmol/L，pH7.6磷磷酸缓冲液平衡好的酸缓冲液平衡好的DEAEsephadex A50柱上柱上吸附，并用吸附，并用pH7.6的的2.550mmol/L的磷酸盐的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活性的洗活性的洗脱液。脱液。 5）冷冻干燥）冷冻干燥（2）以牛肝为原料提取）以牛肝为原料提取Mn

6、-SOD的工艺的工艺牛肝【洗涤】生理盐水【匀浆】pH7.8PBS【离心】上清液【热变性】【离心】655min上清液45、65【分级盐析】【离心】沉淀【溶解】溶液透析液【柱层析】DE-52流出液【超滤】【冻干】冻干粉（NH4）2SO4饱和度【透析】二、胃蛋白酶（二、胃蛋白酶（Pepsin ） 胃蛋白酶：是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞胃蛋白酶：是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞（gastricchiefcell）所分泌，功能是将食物中的）所分泌，功能是将食物中的蛋白质分蛋白质分解解为小的肽片段。为小的肽片段。 胃蛋白酶也是第一个从动物身上获得的酶。胃蛋白酶也是第一个从动物身上获

7、得的酶。 自猪、牛、羊等胃粘膜提取的胃蛋白酶用作助消化药。常与自猪、牛、羊等胃粘膜提取的胃蛋白酶用作助消化药。常与稀盐酸同时用于幼畜消化不良性腹泻和慢性萎缩性胃炎。稀盐酸同时用于幼畜消化不良性腹泻和慢性萎缩性胃炎。 临床上主要用于因食蛋白过多，引起的消化不良及病后恢复临床上主要用于因食蛋白过多，引起的消化不良及病后恢复期消化机能减退等。期消化机能减退等。 1、组成（结构）、性质、组成（结构）、性质 胃中惟一的一种蛋白水解酶。其最适胃中惟一的一种蛋白水解酶。其最适pH值为值为12。 胃蛋白酶作用的主要部位是芳香族氨基酸或酸性氨胃蛋白酶作用的主要部位是芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所组成的肽键。基

8、酸的氨基所组成的肽键。 药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，药用胃蛋白酶是胃液中多种蛋白水解酶的混合物，含有胃蛋白酶，组织蛋白酶，胶原酶等，为粗制的含有胃蛋白酶，组织蛋白酶，胶原酶等，为粗制的酶制剂。酶制剂。 性状：外观为淡黄色粉末性状：外观为淡黄色粉末2、生产工艺、生产工艺（1）工艺路线：）工艺路线：猪胃粘膜猪胃粘膜自溶液自溶液上清液上清液成品成品自溶，过滤自溶，过滤H2O, HCl氯仿氯仿脱脂脱脂浓缩干燥浓缩干燥（2）工艺过程：）工艺过程：自溶、过滤自溶、过滤 在夹层锅内预先加水在夹层锅内预先加水100L及盐酸，加热至及盐酸，加热至50时，时，加入加入200kg猪胃粘膜，快速搅拌使

9、酸度均匀，保持猪胃粘膜，快速搅拌使酸度均匀，保持4548,消化消化34小时。用纱布滤去未消化的组织蛋小时。用纱布滤去未消化的组织蛋白，收集滤液。白，收集滤液。脱脂、去杂质脱脂、去杂质 将滤液降温至将滤液降温至30以下，静防以下，静防2448h，使杂质，使杂质沉淀除去，得到脱脂酶液。沉淀除去，得到脱脂酶液。浓缩干燥浓缩干燥 取脱脂酶液，在取脱脂酶液，在40以下浓缩到原体积的以下浓缩到原体积的1/4，真空干燥，球磨，得到产品。真空干燥，球磨，得到产品。三、尿激酶（三、尿激酶（Urokinase ） 尿激酶是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，尿激酶是一种碱性蛋白酶，由肾脏产生，主要存主要存 在于人和哺乳动

10、物的尿中。人尿在于人和哺乳动物的尿中。人尿平均含有平均含有56U/ml。 临床上，尿激酶已经广泛应用于治疗各临床上，尿激酶已经广泛应用于治疗各种新血栓形成或血栓梗塞疾病。种新血栓形成或血栓梗塞疾病。1.1.组成性质组成性质（1）尿激酶有多种分子量形式，主要有）尿激酶有多种分子量形式，主要有31300、54700两种。尿中的尿胃蛋白酶原在酸性条件下可两种。尿中的尿胃蛋白酶原在酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶，后者可以把分子量以激活生成尿胃蛋白酶，后者可以把分子量54700的天然尿激酶降解为分子量为的天然尿激酶降解为分子量为31300尿激酶。尿激酶。（2）尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤维蛋）

11、尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，血纤维蛋白溶白溶 酶原是它唯一的天然蛋白质底物，它作用于酶原是它唯一的天然蛋白质底物，它作用于精氨酸缬氨酸键使得纤溶酶原转为纤溶酶。精氨酸缬氨酸键使得纤溶酶原转为纤溶酶。（3）尿激酶的）尿激酶的pI为为pH8-9.2.生产工艺生产工艺(1)工艺路线：工艺路线：男性尿液男性尿液10pH8.5上清尿液上清尿液沉淀沉淀pH55.5酸化酸化酸化尿酸化尿硅藻土吸附硅藻土吸附硅藻土吸附物硅藻土吸附物洗涤洗涤硅藻土柱硅藻土柱洗脱洗脱洗脱液洗脱液去热原，去色素去热原，去色素pH8.0流出液流出液CMC柱柱洗脱液洗脱液透析液透析液产品产品（2）工艺过程：）工艺过程：收尿收尿 收集

12、男性尿收集男性尿沉淀处理沉淀处理 尿液冷至尿液冷至10以下，用以下，用NaOH调调pH至至8.5,静置静置1h，虹吸上清液。用盐酸调至，虹吸上清液。用盐酸调至pH5.05.5。硅藻土吸附硅藻土吸附 处理好的尿液加入处理好的尿液加入1%尿量的硅藻土，于尿量的硅藻土，于5C下搅拌吸附下搅拌吸附1h。洗脱洗脱 硅藻土吸附物洗涤装柱，先用硅藻土吸附物洗涤装柱，先用0.02%氨水加氨水加0.1mol/L氯化钠洗脱，当洗脱液油清变混时开始收集氯化钠洗脱，当洗脱液油清变混时开始收集除热源、去色素除热源、去色素CMC浓缩浓缩透析除盐透析除盐四、四、L-天门冬酰胺酶天门冬酰胺酶（L-asparaginase）

13、天门冬酰胺酶是酰胺基水解酶，为抗肿瘤天门冬酰胺酶是酰胺基水解酶，为抗肿瘤酶制剂。肿瘤细胞不能合成生长必需的天酶制剂。肿瘤细胞不能合成生长必需的天门冬酰胺而使其生长受到限制。正常细胞门冬酰胺而使其生长受到限制。正常细胞能合成天门冬酰胺，故受影响较少。因此，能合成天门冬酰胺，故受影响较少。因此，天门冬酰胺酶是一种对肿瘤细胞有选择性天门冬酰胺酶是一种对肿瘤细胞有选择性的抑制药物。的抑制药物。 L-天门冬酰胺酶为白色结晶粉末，微有天门冬酰胺酶为白色结晶粉末，微有湿性，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙湿性，易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙醛、苯等有机溶剂。对热稳酮、氯仿、乙醛、苯等有机溶剂。对热

14、稳定性好，在温度定性好，在温度50下，下，15min后，活性后，活性降低降低30%，60下，下，1小时内失活。小时内失活。工艺路线：工艺路线：大肠杆菌大肠杆菌肉汤培养基肉汤培养基37,48h肉汤菌种肉汤菌种玉米浆玉米浆37,48h种子菌种种子菌种玉米浆玉米浆发酵液发酵液丙酮丙酮干菌体干菌体硼酸缓冲液硼酸缓冲液提取液提取液HAc干粗酶干粗酶甘氨酸甘氨酸酶溶液酶溶液 PEG无热原酶液无热原酶液无菌分装无菌分装L-天冬酰胺酶冻干制剂天冬酰胺酶冻干制剂37,68hpH8.3,48hpH4.24.460,30min不同不同pH处理处理菌种培养菌种培养种子培养种子培养压滤压滤,风干风干提取提取工艺过程：工

15、艺过程： 菌种培养菌种培养 大肠杆菌大肠杆菌37培养培养24h普通牛肉培普通牛肉培养基养基; 种子培养种子培养 16玉米浆，接种量玉米浆，接种量 1 1.5，37，通气搅拌培养，通气搅拌培养 48h;发酵罐培养发酵罐培养 玉米浆培养基，接种量玉米浆培养基，接种量 8，37通气搅拌培养通气搅拌培养 6 8h，离心分离发酵液，离心分离发酵液，得菌体，加得菌体，加2倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，倍量丙酮搅拌，压滤，滤饼过筛，自然风干成菌体干粉自然风干成菌体干粉.提取、沉淀、热处理每千克菌体干粉加入提取、沉淀、热处理每千克菌体干粉加入0.01 mol/LpH8的硼酸缓冲液的硼酸缓冲液10L37搅拌搅拌

16、1.5h，308mol/L醋酸调节醋酸调节pH4.24.4，压滤，滤液加入压滤，滤液加入2倍体积的丙酮，放置倍体积的丙酮，放置34h过滤，收集沉淀，自然风干，得干粗酶过滤，收集沉淀，自然风干，得干粗酶. 取粗制酶，加入取粗制酶，加入03甘氨酸，调节甘氨酸，调节pH8.8搅拌搅拌1.5h离心，上清液离心，上清液6030min热热处理。上清液加处理。上清液加 2倍体积的丙酮，析出沉淀，倍体积的丙酮，析出沉淀，离心，收集酶沉淀，离心，收集酶沉淀，0.01mol/L，pH8磷酸磷酸缓冲液溶解，离心得上清酶溶液缓冲液溶解，离心得上清酶溶液.精制、冻干精制、冻干 调节调节pH8.8离心弃去沉淀，清离心弃去

17、沉淀，清液再调液再调 pH7.7加入加入50聚乙二醇，浓度达到聚乙二醇，浓度达到 16。2 5放置放置 4 5天，离心得沉淀。天，离心得沉淀。蒸馏水溶解加蒸馏水溶解加 4倍量的丙酮沉淀，同法反复倍量的丙酮沉淀，同法反复 1次，次，pH6.4,0.05mol/L磷酸缓冲液溶解，磷酸缓冲液溶解，50聚乙二醇处理聚乙二醇处理 1次，即得无热原的次，即得无热原的 L一天一天门冬酸胺酶。溶于门冬酸胺酶。溶于 0.8mol/L磷酸缓冲液，在磷酸缓冲液，在无菌条件下用无菌条件下用 6号垂熔漏斗过滤，分装，冷号垂熔漏斗过滤，分装，冷冻干燥制得注射用冻干燥制得注射用 L一天门冬酸胺酶成品，一天门冬酸胺酶成品，每

18、每I支支 1万或万或 2万单位。万单位。五、细胞色素细胞色素C（Cytochrome C） 细胞色素：来自三羧酸循环中产生的琥珀酸辅酶细胞色素：来自三羧酸循环中产生的琥珀酸辅酶A，其肽链仅有，其肽链仅有104个氨基酸，体内大量存在，个氨基酸，体内大量存在，一般无需外源补充；且外源补充与体内含量相比一般无需外源补充；且外源补充与体内含量相比甚微。细胞色素甚微。细胞色素C是生物氧化的一个非常重要的是生物氧化的一个非常重要的电子传递体，在线粒体崤上与其它氧化酶排列成电子传递体，在线粒体崤上与其它氧化酶排列成呼吸链呼吸链，参与细胞呼吸过程。，参与细胞呼吸过程。 细胞色素细胞色素C是中枢兴奋药，用于急救

19、或辅助治疗是中枢兴奋药，用于急救或辅助治疗各种原因引起的组织缺氧，如一氧化碳中毒，安各种原因引起的组织缺氧，如一氧化碳中毒，安眠药中毒、高山缺氧等，亦可用于脑缺氧、心肌眠药中毒、高山缺氧等，亦可用于脑缺氧、心肌炎、心肌代偿不全、心绞痛、心肌梗塞、肝炎、炎、心肌代偿不全、心绞痛、心肌梗塞、肝炎、肾炎等。肾炎等。 细胞色素种类较多，可以用光谱学、血红素基团细胞色素种类较多，可以用光谱学、血红素基团的精确结构、抑制剂的敏感度以及还原电势的大的精确结构、抑制剂的敏感度以及还原电势的大小来分辨。小来分辨。 根据辅基的不同，可以将细胞色素大致分根据辅基的不同，可以将细胞色素大致分为三类：为三类： 细胞色素

20、细胞色素a 血红素血红素a（原（原血红素血红素） 细胞色素细胞色素b 血红素血红素b（甲酰血红素）（甲酰血红素） 细胞色素细胞色素d 二氢卟酚（二氢卟酚（Chlorin）的）的衍生物衍生物 细胞色素细胞色素c：与其他三类细胞色素非共价结：与其他三类细胞色素非共价结合血红素不同的是，细胞色素合血红素不同的是，细胞色素c通过分子中通过分子中的半胱氨酸巯基与血红素共价结合。的半胱氨酸巯基与血红素共价结合。工艺路线：工艺路线：新鲜猪心新鲜猪心绞碎绞碎心肌碎肉心肌碎肉H2SO4pH4提取液提取液氨水氨水,人造沸石人造沸石吸附物吸附物25%(NH4)2SO4洗脱液洗脱液(NH4)2SO4滤液滤液浓缩浓缩沉

21、淀物沉淀物透析透析粗品溶液粗品溶液 吸附吸附吸附物吸附物洗脱洗脱洗脱液洗脱液pH7.5比重比重1.211.23CCL3COOH蒸馏水蒸馏水Amberlite IRC-50原料处理原料处理提取提取,压滤压滤中和中和,吸附吸附盐析盐析洗脱洗脱NaHPO4-NaCl精品溶液精品溶液 蒸馏水蒸馏水pH6.4透析透析成品成品双甘肽双甘肽,NaHSO4制剂制剂工艺过程：工艺过程：绞碎、提取、压滤绞碎、提取、压滤 取新鲜或冷冻猪心，去血块、脂肪和肌健等，绞取新鲜或冷冻猪心，去血块、脂肪和肌健等，绞肉机中绞碎。称取心肌碎肉，加肉机中绞碎。称取心肌碎肉，加1.5倍量蒸馏水搅拌均倍量蒸馏水搅拌均匀，用硫酸调匀，用

22、硫酸调pH4左右，常温搅拌提取压滤，滤液用左右，常温搅拌提取压滤，滤液用氨水调节氨水调节pH6.2，离心得提取液。心渣再加等量蒸馏水离心得提取液。心渣再加等量蒸馏水同上法重复提取同上法重复提取1次，合并两次提取液。次，合并两次提取液。 中和、吸附、洗脱中和、吸附、洗脱 提取液加氨水中和至提取液加氨水中和至pH7.5，在冰箱中静在冰箱中静止沉淀杂蛋白，吸取上层清液，每升提取液加止沉淀杂蛋白，吸取上层清液，每升提取液加入入10g人造沸石，搅拌吸附人造沸石，搅拌吸附40min，静置倾去静置倾去上层清液。收集吸附细胞色素上层清液。收集吸附细胞色素 C的人造沸石，的人造沸石，用蒸馏水和氯化钠溶液反复洗涤

23、，然后装柱，用蒸馏水和氯化钠溶液反复洗涤，然后装柱，用用 25硫酸氨溶液洗脱，得洗脱液。硫酸氨溶液洗脱，得洗脱液。盐析、浓缩、透析盐析、浓缩、透析 洗脱液加入固体硫酸镀洗脱液加入固体硫酸镀达到达到 45饱和度，使杂蛋白析出，过滤。饱和度，使杂蛋白析出，过滤。收集透明滤液，缓缓加入收集透明滤液，缓缓加入 20三氯醋酸，三氯醋酸，边加边搅拌使细胞色素边加边搅拌使细胞色素 C沉淀析出，离心沉淀析出，离心收集沉淀。再将沉淀溶于蒸馏水，装入透收集沉淀。再将沉淀溶于蒸馏水，装入透析袋中，透析至无硫酸根为止，过滤得细析袋中，透析至无硫酸根为止，过滤得细胞色素胞色素C粗品溶液。粗品溶液。 吸附、洗脱、透析吸附

24、、洗脱、透析 粗品溶液通过处理好的粗品溶液通过处理好的 Amberite IRC50（NH4）树脂柱吸附，然后将树脂移入大烧杯中，树脂柱吸附，然后将树脂移入大烧杯中，水洗至澄清为止，再分别上柱，用水洗至澄清为止，再分别上柱，用06mol/L磷酸磷酸氢二钠与氢二钠与0.4mol /L氯化钠混合液洗脱，洗脱液用氯化钠混合液洗脱，洗脱液用蒸馏水透析去氯离子，得细胞色素蒸馏水透析去氯离子，得细胞色素C精品溶液。精品溶液。 制剂制剂 取含相当于取含相当于1.5g的细胞色素的细胞色素C精品液，加精品液，加200mg亚硫酸氢钠，搅拌溶解再加双甘肽亚硫酸氢钠，搅拌溶解再加双甘肽1.5g混合均匀，用氢氧化钠调节

25、混合均匀，用氢氧化钠调节pH6.4左右，加注射左右，加注射用水用水100ml，过滤除热原，过滤除热原，6号垂溶漏斗过滤，号垂溶漏斗过滤，测含量，灌注，冷冻干燥，即得每支含测含量，灌注，冷冻干燥，即得每支含15mg细细胞色素胞色素C的制剂。的制剂。习习 题题1.酶成为药物应具备的条件？酶成为药物应具备的条件？2.微生物发酵法生产酶类药物，优良菌种获取的途径有微生物发酵法生产酶类药物，优良菌种获取的途径有哪些？哪些？3.在酶类药物制备过程中，如何保护酶活性？在酶类药物制备过程中，如何保护酶活性？4生物提取法制备酶类药物时，在原材料的选择方面，生物提取法制备酶类药物时，在原材料的选择方面，要注意哪些方面？在原材料的预处理方面，有哪些方法？要注意哪些方面？在原材料的预处理方面，有哪些方法？5微生物发酵法生产酶类药物时，如何进行发酵液的预微生物发酵法生产酶类药物时，如何进行发酵液的预处理？对胞内酶，有哪些细胞破碎方法？处理？对胞内酶，有哪些细胞破碎方法？6试画出试画出L-天门冬酰氨酶的生产工艺流程，并说明工艺天门冬酰氨酶的生产工艺流程，并说明工艺控制要点。控制要点。 Thanks for your attention!