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1、如有侵权，请联系网站删除，仅供学习与交流DNA重组技术的基本工具【精品文档】第 5 页1.1 DNA重组技术的基本工具“工欲善其事，必先利其器”。我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉，就是通过精心设计，用“分子工具”构建成的。培育抗虫棉首先要在体外对含有抗虫基因的DNA分子进行“切割”、改造、修饰和“拼接”，然后，导入棉花体细胞内，并使重组DNA在细胞中表达。实现这一精确的操作过程至少需要三种工具，即准确切割DNA的“手术刀”、将DNA片段再连接起来的“缝合针”将体外重组好的DNA导入受体细胞的“运输工具”。科学家已经找到并运用了这三种必需的工具，才使培育抗虫棉这一奇妙构想变成了现实（图1-1）
2、。图1-1 抗虫棉（左侧为对照）寻根问底根据你所掌握的知识，你能推测这类酶存在于原核生物中的作用是什么吗？限制性核酸内切酶“分子手术刀”切割DNA的工具是限制性核酸内切酶（restrictionen donucleases)，又称限制酶（restriction enzyme）。这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今已从近300种不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。它们能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键（图1-2）断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，例如，EcoRI、SmaI限制酶识别的序列均为6个核苷酸，也有少
3、数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式黏性末端和平末端（图1-3）。当限制酶在它识别序列的中心轴线（图中虚线）两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。生物技术资料卡限制酶的名字怎么起？限制酶的名字是怎么起的呢？是用生物属名的头一个字母与种名的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪个生物中分离出来的。例如，一种限制酶是从大肠杆菌（Escherichia coli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示；如果它是从大肠杆菌R菌株中分离出来的第一个限
4、制酶.则进一步表示成EcoRI 。DNA连接酶“分子缝合针”将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两条DNA链连接起来的酶，称之为DNA连接酶（DNA ligase）。根据酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为Ecoli DNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4DNA连接酶。这两类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键（图1-4），但这两种酶的作用有所差别：Ecoli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起
5、来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。而T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？基因进入受体细胞的载体“分子运输车”用什么方法才能将外源基因送入细胞中呢？通常是利用质粒（plasmid）作为载体（vector），将基因送入细胞中。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
6、携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。质粒DNA分子上有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因，供重组DNA的鉴定和选择（图1-5）。在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体的衍生物、动植物病毒等。它们来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别。这些基因工程载体的作用，就相当于一种运输工具，因此将它们比喻为“分子运输车”。在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。模拟制作目的要求模拟重组DNA分子的操作过程，说出其基本原理。材料用具两种
7、颜色（如绿色和粉红色）的硬纸板，剪刀（代表EcoR),透明胶条（代表DNA连接酶)。方法步骤1. 选两种颜色的等宽硬纸板，如绿色纸板和粉红色纸板。在绿硬纸板上依次等距离写上下列字母（字母要清晰、工整)：在粉红色硬纸板上依次等距离写上下列字母:2.用剪刀（代表EcoRI）进行DNA“切割”。先分别从两块硬纸板上的一条DNA上找出G-A-A-T-T-C序列，并选G-A之间作切口进行“切割”然后再从另一条链上互补的碱基之间寻找EcoRI相应的切口剪开。3.待绿、粉红两色硬纸板上的切割位点全部切开后，将粉红色纸板上的DNA片段，重组到绿色硬纸板的切口处。此时用不干胶（代表DNA连接酶）将切口黏结起来。
8、这样你就完成了一个重组DNA分子的模拟制作。如果你的操作是正确的，不同颜色的黏性末端能互补配对。如果你制作的黏性末端不能互补配对，说明你的操作有误，应重新做一次。思考与讨论请按真实操作过程思考一下：1.你模拟插入的DNA片段能称得上一个基因吗？2.如果你操作失误，碱基不能配对，可能是什么原因造成的？进一步模拟操作如果你有兴趣，可自制有切割位点的纸板，然后按上述步骤剪切和连接，制成一个新的重组DNA分子。思考与探究1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：你能用DNA连接酶将它们连接起来吗？_和_能连接形成_;_和_能连接形成_;_和_能连接形成_;_和_能连接形成_。2.联系你已有的知识，想一想，为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?3.天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？