最新Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版).doc

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1、精品资料Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版).Trizol法使用步骤 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen(可能需要)、 1.5ml Eppendorf管(RNase-free)、 Tips(RNase-free) 三、准备工作 RNase酶非常稳定,是导致RNA降解

2、最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与RNA制备有关的分子生物学实验时,必须戴手套。 RNase的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂,一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 1、 料制品的处理 尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明RNase-Free 的塑料制品,如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制

3、品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下: 1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意:DEPC为剧毒物,活性很强,小心在通风柜中使用。 2)处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 3)在通风柜中室温处理过夜。 4)将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 5)烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、 璃玻和金属物品 250C烘烤3小时以上。 四、从组织中提取总RNA 1)液氮研磨:组织块直接放入研钵中,加入少量液氮

4、,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol,转入离心管进行第2步操作。 (液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。终止细胞内外一切生物反应,防止RNA酶的降解反应)2) 匀浆:组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外,组织体积不能超过Trizol体积的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 五、从细胞中提取总RNA 1) 培养贴壁细胞:不须消化,可直接用Trizol进行消化、裂解,Trizol体积按10cm2/ml比例加入。 2) 悬浮

5、细胞可直接收集、裂解,每1ml Trizol可裂解5106动物、植物或酵母细胞,或107细菌细胞。 六、操作步骤 1、细胞或组织加Trizol后,室温放置5min,使其充分裂解。注:此时可放入-70长期保持。 2、12,000rpm 离心5min,弃沉淀。 3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿,振荡混匀后室温放置15min。注:禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂。 (氯仿为有机溶剂,有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合,从而使得蛋白和RNA脱离,RNA进入水相)4、4 12,000g离心15min。 5、吸取上层水相,至另一离心管中。注:千万不要吸取中间界面

6、;若同时提取DNA和蛋白质,则保留下层酚相存于4冰箱,若只提RNA,则弃下层酚相。 6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇(沉淀RNA)混匀,室温放置5-10min。 7、4 12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底。 8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇(沉淀RNA),温和振荡离心管,悬浮沉淀。 9、 4 8,000g离心5min,尽量弃上清。 10、室温晾干或真空干燥5-10min。 注:RNA样品不要过于干燥,否则很难溶解。 11、可用50ul H2O,TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品,55-60,5-10min。注:H2

7、O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。(TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成,主要用于溶解核酸,能稳定储存DNA和RNA。用于酶切反应不能使用SDS)12、测O.D值定量RNA浓度。注:此方法提取RNA A260/A280值在1.6-1.8之间;产率估计:组织标本:(ug RNA/mg组织)1-10ug,培养细胞(ug RNA/106 Cell):5-15ug。注:组织或细胞量过少,可酌情减少Trizol用量;组织或细胞用量过多,会引起DNA对RNA的污染;高蛋白、脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液氮研磨后须4 12,000g离心10min去掉不溶物,再进行

8、下面操作,若顶层有脂肪物,则也须去掉;热天提RNA,带手套是必须的,手是RNase的主要来源;组织块用液氮研磨,效果最好,若没有液氮或电动匀浆器,可用手动匀浆器代替,此时组织块不宜过大,且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎,然后再充分研磨。 6.1.2.1 肝脏、肠道、肌肉总RNA提取方法使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开,从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织,置于离心管后立即放入液氮中;组织在液氮下研磨成粉,取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中,充分混合后于4,12,000rpm离心15min;取上清移至新1.5ml离心管中,加入200ul氯仿,剧烈震荡直至呈乳白色,于4

9、,12,000rpm离心15min;取上清移至新1.5ml离心管中,加入500ul异丙醇,轻轻颠倒10次,冰上放置20mins,于4,12,000rpm离心15min;弃上清,加入1ml75%乙醇(用DEPC水现配现用),于4,12000rpm离心5min,重复此步骤一次;弃上清后,室温干燥5-7mins;加入适量(20-30ul)的DEPC水溶解沉淀65溶解,-20(最好-80)保存,检测RNA浓度,并电泳检测。6.1.2.2 RNA浓度测定和电泳检测取2ul提取好的RNA溶液,于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度,纯

10、净RNA的A260/A280应在1.8-2.2之间。电泳检测:1%琼脂糖,1ATE缓冲液,90V电泳30min,凝胶成像系统观察,分析结果。 6.1.2.3 肝脏、肌肉、肠道样品cDNA的合成 反应按照TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(Perfect Real Time) 反转录试剂盒说明书进行,合成cDNA模板。(残存的)基因组DNA的除去反应,在PCR管中配置如下缓冲液。 试剂用量5gDNA Eraser Buffer2.0 lgDNA Eraser1.0 lTotal RNAX* ulRNase Free dH2Ou

11、p to 10 l(gDNA、genomic DNA、基因组DNA:是指有机体在单倍体状态下的DNA全部含量,是染色体DNA,与质粒等染色体外DNA区别。) X*:根据检测到的RNA浓度来配置;混合均匀后,室温放置20-30min反转录反应,在PCR管中配置如下缓冲液(20ul system),反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,先按反应数+1的量配制Master Mix ,然后再分装到每个反应管中。 试剂使用量5PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4.0 ulPrimeScript RT Enzyme Mix I1.0 lRT Primer Mix1.0 l的反应液10.0 ulRNase Free dH2Oup to 20 l 混合均匀后,在PCR仪上进行逆转录反应,反应条件为:37 15 min85 5 sec然后将得到的cDNA存放于-20冰箱保存待用。

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