最新BD FACSCalibur流式细胞仪培训手册.doc

上传人:1595****071 文档编号:33832351 上传时间:2022-08-12 格式:DOC 页数:32 大小:1.23MB
返回 下载 相关 举报
最新BD FACSCalibur流式细胞仪培训手册.doc_第1页
第1页 / 共32页
最新BD FACSCalibur流式细胞仪培训手册.doc_第2页
第2页 / 共32页
点击查看更多>>
资源描述

《最新BD FACSCalibur流式细胞仪培训手册.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《最新BD FACSCalibur流式细胞仪培训手册.doc(32页珍藏版)》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、精品资料BD FACSCalibur流式细胞仪培训手册.BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍表面抗原流式分析有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用,请至本公司网站订阅FACSinformation电子报。如需要本课程手册,欢迎至本公司网站下载 。如需要免疫荧光染色方法,请至本公司网站下载 。一、BD FACSCalibur基本结构1.1仪器本体:1. 电源开关:在BD FACSCalibur仪器右侧下方,先启动仪器本体,再打开计算机。2. 光学系统:BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射以BD FACS

2、Calibur 基本型为例 FSC Diode 只收488 nm波长散射光 SSC PMT 只收488 nm波长散射光 FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围(波长515-545 nm) FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围(波长564-606 nm) FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围(波长 650 nm)3. 仪器面板:仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。流速控制:LO: 样品流速:12 ml /minMED:样品流速:35 ml /minHI: 样品流速:60 ml /min功能控制: RUN:此时上样管加压,使细胞悬液从进样针进入流动室。(正常显示绿

3、色;黄色时表示仪器不正常,请检查是否失压。) STANDBY:无样品或暖机时之正常位置,此时鞘液停止流动,雷射功率自动降低。 PRIME:去除流动室中的气泡,流动室施以反向压力,将液流从流动室冲入样品管,持续一定时间后,以鞘液回注满流动室。PRIME 结束,仪器恢复STANDBY状态。4. 储液箱抽屉:在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开,内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter,及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。 鞘液筒:位于抽屉左侧,容积4升。装八分满鞘液筒,仪器可以运行大约 3小时。筒上装有液面感应器,鞘液用完时,仪器软件上

4、会有显示。鞘液筒盖上有金属环扣,保证鞘液筒密闭。 废液筒:位于抽屉右侧,容积4升。筒上装有液面感应器,废液盛满时,仪器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。 鞘液过滤器:0.22mm过滤器,去除鞘液中的杂质,保证进入流动室的鞘液是干净的。 气路减压阀:沿箭头方向移动阀门开关,鞘液筒减压,气压恢复正常。在鞘液筒添加鞘液时,需要减压。 空气过滤网:用于过滤冷却雷射的空气。5. 上样品区:上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部分,一个是进样针 Sample Injection Tube,将样本输入流动室,还有就是支撑架 Tube Support Arm、和液滴存留系统 Droplet C

5、ontainment System。 进样针:是一根不锈钢管,将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套管,是液滴保留系统的一部分。 支撑架:用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置:位于样本管之下的中位,样本管左侧或右侧。液滴存留系统:系统由支撑架、真空帮浦和外套管组成。当支撑架位于左侧或右侧位置时,真空帮浦就会启动,将液体从外管吸入废液筒内。上样时,须注意将支撑架位于中位,以避免过多样品被抽吸到废液筒内(当支撑架位于中位,真空帮浦停止工作)。更换样品时,让仪器保持RUN的模式,使得进样针可以反冲;切换到STANDBY模式前,确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到流动室中。1.2

6、Macintosh计算机与打印机:准备您的细胞样品1. 理想样品浓度调至1-10 X 105 cells/ml?一般实验只需0.5 ml的样品。2. 细胞样品务必放至BD FALCON 352052 试管中,否则无法上机。3. 上机前务必去除样品中之细胞团块,以防止管路堵塞?可使用附滤网BD FALCON试管 (Cat. No.352235) 或35-55 mm的尼龙筛网。4. 供流式分析的样品是单细胞悬浮液,而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原荧光染色的方法大致有两种:直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。研究生可至本公司网站下载染色方法 直接免疫荧光染色 Lysed - No - Wash P

7、rocedure Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27 Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure Leukemia and Lymphoma Procedure 1 Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell Clonality Assay 间接免疫荧光染色 滴定抗体浓度 常用试剂5. 如因特殊因素无法下载上述实验方法,请e-mail:或 。二、开机、关机标准操作2.1 FACS Calibur 开机1. 开启细胞仪电源。2. 开启其它周边配备电源

8、,如打印机及MO机。3. 开启计算机。4. 确认鞘流液筒有八分满的FACS Flow,确实旋紧 (鞘液筒容量为4L)。5. 将废液倒掉,并在废液筒中加入200 ml 家用漂白水 (废液筒容量为4L)。6. 将减压阀方向调在加压(Pressurize)位置。7. 排除液流管路与过滤器中的气泡。8. 取下样品管,执行 PRIME 功能两次。9. 使用1ml PBS,HIGH RUN 两分钟。10. 可开始分析样品。2.2 FACS Calibur 关机关机前必要动作:清洗进样管和外套管,防止进样管堵塞、或有染料残留。1. 将样品支持架左移,取 2 ml FACSClean(10%Bleach)上样

9、品,让仪器的真空系统抽取约 1 ml 的液体。2. 将样品支持架回正,按 HI RUN,然后让 FACSClean 清洗管路10分钟。3. 按 Standby,取下样品管,执行 PRIME功能两次。4. 取 2 ml dH2O,重复上述步骤1-3。5. 注意最后只留约 1 ml dH2O 在试管中。6. 按 STANDBY 五分钟,使风扇冷却雷射后,关闭细胞仪(必要动作,以保护雷射光源。)7. 倒掉废液,并回填 200 ml漂白水。8. 将减压阀放在VENT 漏气位置。将鞘流液筒充填至八分满。9. 退出软件“File”“Quit”(如有对话选项,选择“Dont save”)。确认退出计算机中所

10、有BD应用软件,所有数据数据已储存备份。10. 关闭计算机。“Special”“Shutdown”。三、上机分析流程建议首次试机避免进行大量试验,仅需准备下列样品。(1)Negative Control(不加任何抗体)。(2)CD3-FITC(FL1 单染)。(3)CD19-PE(FL2 单染)。(4)CD3-FITC /CD19-PE(FL1/FL2 双染)。3.1 Calibur 开机1. 先开启细胞仪本体再打开计算机。 *秘技1:如顺序相反,仪器和计算机之间无法建立正常通讯,无法执行“connect to cytometer”。 解决之道,两者都关机、然后以正确方式重开。2. 向前拉开储

11、液箱抽屉,检查鞘液筒、废液筒水量,如需充填鞘液,将减压阀方向调在VENT位置(箭头方向)。3. 仪器会对鞘流液筒打气加压,请确认筒盖确实旋紧。 *秘技2:将减压阀方向调在加压(向前)位置。减压阀如在VENT(箭头方向)位置,按RUN功能键时将显示橙黄色(表示仪器不正常,请检查是否失压),正常为绿色显示。3.2开启CellQuest 软件、编辑实验文件4. 在苹果菜单下点击CELLQuest 启动软件。桌面会出现一Untitled 实验文件,可点击实验文件的右上角的放大钮,将实验文件窗口放大。5. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击,拖曳对角线至适当大小,然后放开鼠标。出现散点图对

12、话方框。6. 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source,选择Acquisition (收取) ,确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。在颜色方框中点击Multicolor Gating(收取样品时,门内细胞将出现颜色)。点击OK。此时实验文件会出现FSC/SSC散点图。7. 说明:散点图(Dotplot),又称二维散点图是流式分析最常用图谱,它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中,横坐标X轴为为荧光1强度的相对值,单位是道数,纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设为FS

13、C-H 1024、SSC-H 1024;第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数,并依需要选择之(FSC:细胞大小,SSC:细胞折射率,FL1:FITC绿色荧光,FL2:PE橙色荧光,FL3:PerCP红色荧光)。8. 从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能,可复制一个同样大小的散点图,在出现的对话方框内选择X轴:FL1-H 1024,Y轴:FL2-H 1024。点击OK,FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。9. 在工具板中选择四象限工具,在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在

14、(x,y)(101,101)处,这些象限将指定阴性/阳性区域。建立仪器和计算机之间通讯10. 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer,此时会出现Acquisition Control 对话方框。如果无法选择Connect to Cytometer,参考秘技 #1。如果没见到Acquisition Control 对话,可到屏幕上方Windows菜单中选择Show Acquisition Control。仪器设置文件注意:实验数据质量,取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改,研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件(Instru

15、ment settings),含信号器高压(Detector/ Amps),阈值(Threshold),荧光补偿(Compensation)等仪器条件的组合。一般而言,仪器设定的顺序为Detector/Amps - Threshold - Compensation。11. 检查现有仪器条件,从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC为LIN(线性放大),其它FL1-3为LOG(对数放大),将其拖至空白区。12. 从Cytometer菜单中选择Threshold,出现 Threshold

16、 窗口在Threshold 窗口:确认FSC为设阈参数,初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。13. 从Cytometer菜单中选择Compensation,确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白区。3.3 上样品、设置仪器14. 使仪器处于High RUN,支撑架左移,上阴性对照管样品,支撑架回位。确认Acquisition Control 窗口中 Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据),点击Acquire。 调节FSC/SSC探测器(电压)15. 观察FSC/SSC图的变化。FSC电压(Voltage)预设为E00,可调节 Amp Gain 从1.009.99 使主要细胞群得以清楚显示(

17、如细胞较大,将FSC电压设置于E-1;较小细胞,将FSC电压设置于E01)。调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC图的原则,在于能得到一独立离散的细胞族群,该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后,点击Acquisition Control 窗口中的Pause。Gating 圈选细胞检品中,常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射与侧方散射的二维位图,即散射光图谱(Scatter Plot),来圈选出不同细胞群的范围,选择性显示出有意义的细胞群体,如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。16. 在工具板中选择多边形的Region,在FSC/SSC散点图上划定

18、淋巴细胞R1 区域(如下图)。分析样品时,区域内细胞应会呈现成红色,可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。如果要删除R1区域,您可以在工具栏中点选Gates Region list ,以鼠标点选 R1,再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后,可用绘图工具板,重画R1。17. 选取希望Gate的FL1/FL2散点图,从Plots菜单中选择Format dot plot。在出现的对话方框内,将No Gate 改选 G1=R1。点击OK。 调节FL1、FL2的探测器(电压)18. 点击Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中调节F

19、L1、FL2的电压,使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之100-101处。19. 在Threshold 窗口,适当地提高FSC阈值52,以去除碎片或低阶噪音。唯需注意不要切掉主要细胞族群。 20. 点击Acquisition Control 窗口中的Pause、Abort。移去阴性对照管,关闭Detector/Amps、Threshold窗口,我们已设定好有意义细胞群之自体荧光。调节荧光补偿说明:最适化的最后一步是调节光谱重迭。(如是单色荧光实验可跳过此步骤)如是2色样本,必要时需调节FL2-%FL1,FL1-%FL2(若3色样本,必要时需调节FL2-%FL1、F

20、L1-%FL2、FL3-%FL2、FL2-%FL3的补偿)。21. High RUN,换上单染CD3-FITC管。点击Acquisition Control窗口中的Acquire。调节FL2-%FL1使FITC阳性细胞在FL1/FL2散点图的右下象限。补偿调节可通过点击来选择或直接拖动滑标上下移动。调节完毕,点击Acquisition Control窗口中的Pause。22. 移去单染CD3,换上单染CD19-PE管。点击Acquisition Control窗口中的Restart。调节FL1-%FL2使PE+细胞在FL1/FL2散点图的左上象限。调节完毕,点击Acquisition Cont

21、rol窗口中的Pause。23. 最后以CD3-FITC/CD19-PE双染样本上机,点击Acquisition Control窗口中的Restart,确定三群细胞工整垂直。当您已完成2色荧光之光谱重迭时,点击Acquisition Control窗口中的Pause、Abort。24. 移去样本管,换上dH2O管,让仪器暂且处于Standby状态。关闭Compensation窗口。您已完成2色荧光之最适化。3.4收集实验数据决定储存细胞总数25. 预设之储存细胞总数为10000。如需修改,从Acquire菜单中选择Acquisition & Storage,并在出现的窗口功,确认Collect

22、ion Criteria从10000 of All,再点击OK。 26. 找个档案匣准备储存数据。从Acquire 菜单中选择Parameter Description,出现Parameter Description对话方框。点击Folder,并在随后出现之对话方框,选择Your Folder或新建活页夹,点击此对话方框的Select Your Folder。27. 命名即将储存之文件名:点击Parameter Description对话方框的File,出现文件名编辑窗口。在Custom Prefix中:输入文件名20031231,点击此对话方框的OK。日期为最常用之文件名系统。28. Opt

23、ional:如有需要,可选择或在P1-P5后的空格中输入相关参数名。如P1:Size, P2:Granularity, P3:CD3 FITC。输入参数名会存入实验档案中,显示在图谱上。计数器Counters29. 从Acquire 菜单中选择Counters. 窗口会显示样品分析速率、与总数进度。收集实验数据30. 你可以开始收集实验数据了。HIGH RUN,将第一管样品放到检测区,在Acquisition Control窗口中,将 Setup 改成 Setup,此时CellQuest会自动显示 Your Folder:20031231.001为资料文件名。点击“Acquire” 便可启动样

24、品之分析测定与数据储存。当计算机成功地收取足够数据,会自动储存数据文件20031231.001,并会以“嘟”声告知,CellQuest会自动升幂附加档名成20031231.002。等待下一指示。31. 你可以换上下一管样品,点击“Acquire” 启动样品之分析测定与数据储存。可继续分析直到所有检品都分析完毕。3.5实验数据之储存与备份:32. 不建议长期使用硬盘储存数据数据,可考虑以烧光盘(如配有 CD-RW)、口袋硬盘(Flash Drive)来备份大量实验数据,以免占用原有硬盘的内存,影响数据处理速度。可将备份后之数据,拿到另一苹果计算机或个人PC进行离机分析。33. 确认所有档案皆己备

25、份后,以鼠标圈选欲删除数据,将其拖拉至Trash筒。退出软件34. 检品分析完毕后,记得从屏幕上方 File 指令栏选择 Save As,储存实验文件,以备日后使用,不需每次重新编辑。35. 从屏幕上方 Cytometer 指令栏,选择Instrument Setting,出现Instrument Setting窗口。点系print打印此次实验条件,可贴入实验笔记留底,再点击Save以储存此一实验的仪器条件,供日后再使用。点系SAVE后会出现文件保存对话方框,选择文件目录及文件名(例:Your Folder:/Your Setting1),点击Save。点击Done。36. 检品分析完毕后,用

26、鼠标从屏幕上方 Acquire 指令栏中,选取Disconnect to Cytometer 以断绝计算机与仪器间之联机。之后如不分析数据,您可退出软件“File”“Quit”(遇有选项永远选择“Dont save”),进行关机程序。 管路清洗37. 以2 ml 10 漂白水取代样品,将样品架置于左位以外管吸除约1 ml,再将样品架置于中位 HI RUN 十分钟。改用 2 ml DI water。重复上述程序,样品架上留约 1 ml DI water 。按STANDBY五分钟。关主机、关计算机四、数据分析FCS list mode数据文件:说明:FCS list mode数据文件是流式细胞仪的

27、标准格式档案(FCS2.0)。该文件含有从流式细胞仪收取的平均10,000个细胞数的资料,含有46个参数。一般软件无法打开list mode数据文件,需藉助如CellQuest, WinList, WinMDI, 等Flow 分析软件,才可开启、绘图、并进行分析统计。4.1 开启一CellQuest实验文件1. 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出现一Untitled 实验文件,可点击实验文件的右上角的放大钮,将实验文件窗口放大。4.2散点图之统计分析(双色)2. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击,然后拖动对角线至适当大小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot P

28、lot对话框。3. 在Dot Plot方框中,Plot Source应预设为Analysis,可点击 Select File 钮,并用随后之方框来开启预存之 Sample Files,它们的路径位于Mac HD:BD Applications:CellQuest Folder:Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录,找到档案后,点击 Open来开启 NORM001 档案。X 与 Y 参数项会出现默认值FSC-H 256 与 SSC-H 256,在Color方框中点击Multicolor Gating,确认无误之后,点击 OK 便完成了一个 NORM001 的 FSC /SSC散点图

29、。4. 工具板中选择多角形区隔工具,将Cursor 移至FSC/SSC散点图上,并沿着淋巴球聚落周边画出范围,连点击两次可关闭该区域。你已完成 R1区域的界定,我们将以此区域来圈选淋巴细胞。(如果要删除R1区域,您可以在工具栏中点选Gates Region list,以鼠标点选 R1,再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后,可用绘图工具板,重画R1。)5. 从Plots菜单中选择Dot Plot可复制一个同样大小的散点图,屏幕上会出现一 Dot Plot 对话方框。点击X Parameter 钮来显示 NORM001 档案中所有的参数项 (FSC, SSC, FL1, FL2) 将

30、 X 参数项改成FL1-H 256 Gamma-1,Y 参数项改成FL2-H 256 Gamma-2。从Gate输入栏中将 NoGate 改成G1= R1。6. 点击 OK 便完成了一个以 G1 圈选的 FL1/ FL2 散点图,可将复制图移至原图右方。NORM001 档案为本组实验之阴性对照组,我们将以之来界定阴性与阳性之界限。7. 从屏幕左列工具板中,选取 Quadrant Marker 工具,然后在 FL1/ FL2 散点图中心处点击并拖曳至定点,一般而言是紧挨着阴性细胞聚落。8. FL1/ FL2 二维散点图现在被区隔出四个象限,欲计算各象线中细胞的数据数据,从屏幕上方Stats菜单中

31、选择Quadrant Stats。可以得到该图之四象限统计结果。UL:左上象限,UR:右上象限,LL:左下象限,LR:右下象限打印报告、输出统计数值9. 从屏幕上方File菜单中选择Print One,可以打印工作中实验文件。10. 点选四象限统计表,从屏幕上方File菜单中选择Export Statistics可输出统计数值至Excel档案。在出现方框中命名档案,并决定欲存放档案匣,点击Save。4.3 开启其它List Mode Data11. 如欲接着分析存在同一档案匣之系列档案,可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文件中所有图谱的四角会出现黑色方块,表示被选择上) ,接着从Plots菜单

32、选择Next Data File,软件会自动以新档案来替换现有档案,您只要确认圈选范围、与 Quadrant Marker 的位置是否恰当,即可打印报告、或输出统计数值。12. 对于存在不同档案匣之系列档案,可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文件中所有图谱的四角会出现黑色方块,表示被选择上) ,接着从Plots菜单选择Change Data Files,并在随后出现之对话方框,选择所在新目录与欲分析档案。点击OPEN。可调整圈选区域,Quadrant Marker阴阳界限,软件会重新计算、统计报告。13. 常规使用之实验文件 (内含散点图、圈选区格、四象限分界、以及统计报告) ,我们建议您将它

33、另存新档 File Save As,以备后需,分析其它档案便轻而易举。4.3直方图之统计分析(单色)1. 从屏幕上方File 菜单中选择New。桌面会出现一Untitled 实验文件,可点击实验文件的右上角的放大钮,将实验文件窗口放大。2. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击,然后拖曳对角线至适当大小。Plot 拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot对话框。3. 在Dot Plot方框中,Plot Source应预设为Analysis,可点击 Select File 钮,并用随后之方框来开启预存之 Sample Files,它们的路径位于Mac HD:BD Applicatio

34、ns:CellQuest Folder:Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录,找到档案后,点击 Open来开启 NORM001 档案。X 与 Y 参数项会出现默认值FSC-H 256 与 SSC-H 256,在Color方框中点击Multicolor Gating,确认无误之后,点击 OK 便完成了一个 NORM001 的 FSC /SSC散点图。4. 工具板中选择多角形区隔工具,将Cursor 移至FSC/SSC散点图上,并沿着淋巴球聚落周边画出范围,连点击两次可关闭该区域。你已完成 R1区域的界定,我们将以此区域来圈选淋巴细胞。(如果要删除R1区域,您可以在工具栏中点选Gat

35、es Region list,以鼠标点选 R1,再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后,可用绘图工具板,重画R1。)5. 从Plots菜单中选择Histogram,屏幕上会出现一 Histogram 对话方框。点击 Select File 钮,再点击 Open来开启 NORM001 档案。说明:直方图(Histogram)表明一个参数与细胞数量之间的关系,在图中,横坐标X轴为荧光或光散射强度的相对值,单位是道数(channel number),纵坐标Y轴则通常表示细胞出现的频率,即相对细胞数。6. 点击 Parameter 钮来显示 NORM001 档案中所有的参数项,将参数项改成

36、FL2-H 256 Gamma-2。从Gate输入栏中将 No Gate 改成G1= R1,点击 OK 便完成了一个以G1圈选的 FL2直方图,图形的 X 轴为橙黄色荧光强度,Y 轴为细胞频率,NORM001 档案为本组实验之阴性对照组,我们将以之来界定阴性与阳性之界限。7. 从屏幕左列工具板中,选取 Histogram Marker 工具,然后在图的左缘处点击并拖曳至定点,一般而言是阴性信号的右缘。放开鼠标后即完成Marker 1(M1)。重复前述步骤以增画另一Marker,一般而言 M2 始自 M1 的右缘,终于图的右界。8. FL2 直方图现在被区隔出两个区域,欲计算各区域中细胞的数据数

37、据,可从 Stats 指令栏中选择 Histogram Stats。打印报告、输出统计数值9. 从屏幕上方File菜单中选择Print One,可以打印工作中实验文件。10. 点选四象限统计表,从屏幕上方File菜单中选择Export Statistics可输出统计数值至Excel档案。在出现方框中命名档案,并决定欲存放档案匣,点击Save。4.3 开启其它List Mode Data11. 如欲接着分析存在同一档案匣之系列档案,可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文件中所有图谱的四角会出现黑色方块,表示被选择上) ,接着从Plots菜单选择Next Data File,软件会自动以新档案来替换

38、现有档案,您只要确认圈选范围、与 Quadrant Marker 的位置是否恰当,即可打印报告、或输出统计数值。12. 对于存在不同档案匣之系列档案,可用鼠标以拖曳方式选取所有图表 (文件中所有图谱的四角会出现黑色方块,表示被选择上) ,接着从Plots菜单选择Change Data Files,并在随后出现之对话方框,选择所在新目录与欲分析档案。点击OPEN。可调整圈选区域,Markers界限,软件会重新计算、统计报告。13. 常规使用之实验文件 (内含散点图、圈选区格、四象限分界、以及统计报告) ,我们建议您将它另存新档 File Save As,以备后需,分析其它档案便轻而易举。五、错误

39、信号、疑难排除5.1 仪器状态(Status): 在CELLQuest菜单位于Cytometer菜单中。用来在收取的任何时候查看流式细胞仪的运行状态,以利解决仪器运行中出现的问题。状态:显示仪器运行模式Not Ready:激光器正在预热、鞘液桶空、废液桶满。Ready:样本管放置在进样区,且支撑臂位于中位,样本管加压,仪器在RUN状态。Standby:仪器在Standby 状态、或仪器在Run 状态而无样本管在进样区上、或支撑架位于侧位、或样本管未完全加压。Standby时仪器的雷射电源降低。5.2 常见故障排除程序5.2.1 样品试管上不去 误用不适合的试管。(请用BD Falcon 352

40、052) 试管支持架需调整。旋转调整试管支持架(顺时钟向下、逆时钟向上)。 Bal Seal 磨损。(汰换 Bal seal)5.2.2 仪器处于N0T READY状况检查以下情况: 鞘液筒中的鞘液是否用完。 废液筒中的废液是否已装满。 开机需要5分钟时间预热。 鞘液筒的液面检测器连接是否松动、或未连接。5.2.3 仪器处于STANDBY状况(仪器失压)如果仪器未加压,上样管放好后,虽然控制面板处于RUN模式,但仪器仍未能达到READY状况,此时仪器仍处于STANDBY状况。这可能是由于鞘液筒盖漏气、压力阀未加压,样本管不能被加压等原因造成的压力问题。此时,样本不能良好地进入流动室,无法检测。

41、此时,检查以下情况: 压力阀未加压。 鞘液筒是否漏气(盖紧鞘液筒盖)。 样本管是否有破损。 上样针上的Bal seal是否己磨损。 鞘液筒上的蓝色接头是否连接好。5.2.4 仪器讯号噪声过高鞘液过滤器中有气泡,仪器记录了气泡产生的信号,造成了噪声数据的干扰。气泡还可以改变样本流,造成检测结果不理想;此时,仪器需要做PRIME,排除液路中的气泡干扰。如果鞘液筒吸干了,应该重新装满鞘液,然后先取下样品管进行5-10次PRIME,再换上3ml dH2O上样管HI RUN 30分钟,待鞘液流中的气泡排除之后,再进行样本测定。5.2.5 计算机屏幕上见不到细胞显示检查以下情况: 如果仪器一直处于STAN

42、DBY状态,则检查System Status。 如果STATUS窗日显示READY,则检查样本管中细胞浓度是否够,上样前是否混匀了。 检查实验的Instrument Settings是否正确。 检查阈值是否设置过高,导致无法检测目标细胞群。 检查CELLQuest软件Cytometer目录下的Status窗口,是否己被更新。如果未更新,说明仪器与计算机之间的通讯发生了故障,此时,应关闭计算机和FACSCalibur,重新打开仪器,继续实验。 PRIME仪器液流,去除流动室中可能存在的气泡。若流动室中存在气泡,可能使样本流的位置偏离激光束,导致无细胞信号。5.2.6 加样针有鞘液反流检查以下情况

43、: 检查上样针外管是否安好,可以将外管旋下,向上推动,重新拧紧。 更换上样针上部的O型胶环。 检查液流保存系统的真空帮浦是否工作。如果样本管支撑架位于旁位时,听不到真空帮浦的工作声音,可能是真空帮浦停了,关闭FACSCalibur,再启动;移开支撑架时,如果马达仍然不动,请致电BD客户服务部门寻求帮助。实验文件1:2 Color ACQ实验文件2:2 Color ANA表一、常用荧光染剂测量参数荧光染剂吸光波长(nm)荧光波长(nm)标示抗体用染剂Fluorescein, FITC490520Phycoerythrin-R, PE495578Peridinin-chlorophyll, Per

44、CP490677Cy-Chrome495670PE-Texas Red495620PE-Cyanine 5495670核酸含量分析Ethidium Bromide510 (+ds DNA)595Propidium Iodide,PI536 (+ds DNA)623Acridine Orange480 (+ DNA)440-70 (+ RNA)520650Thiazole Orange509 (+ RNA)533Pyronine Y560-562 (+ds RNA)497 (+ss RNA)565-574563细胞 ViabilityPropidium Iodide,PI536 623YOPRO-1480515Acridine Orange4805207-AAD488670细胞膜电位DiO-C6 (3)485510Mitochondrial 膜电位Rhodamine 123485546

展开阅读全文
相关资源
相关搜索

当前位置:首页 > 教育专区 > 小学资料

本站为文档C TO C交易模式,本站只提供存储空间、用户上传的文档直接被用户下载,本站只是中间服务平台,本站所有文档下载所得的收益归上传人(含作者)所有。本站仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容本身不做任何修改或编辑。若文档所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知淘文阁网,我们立即给予删除!客服QQ:136780468 微信:18945177775 电话:18904686070

工信部备案号:黑ICP备15003705号© 2020-2023 www.taowenge.com 淘文阁