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1、_第一讲 概论1、至今生物技术的发展史上经历了三个浪潮，分别是？医药、农业、工业2、什么是工业生物技术？ 3、什么是生物炼制？ 生物炼制可分为 木质纤维素炼制 、 全谷物炼制 和绿色炼制4、工业生物技术重大产品系列包括哪些？生物能源 、 生物材料 、 生物基化学品第二讲 发酵概论1、发酵的定义？（1）原本指在厌氧条件下葡萄糖通过酵解途径生成乳酸或乙醇等的分解代谢过程。 (2)现在从广义将发酵看作是微生物把一些原料养分在合适的发酵条件下经特定的代谢转变成所需产物的过程。 2、有氧发酵与厌氧发酵的区别？介绍的产品中哪些是有氧发酵？哪些是厌氧发酵？ （1）有氧发酵：需要氧气，代谢特点：吸收O2 ，放
2、出CO2 ,H2O，产生大量热，消耗少量营养经分解代谢所产生的能量可以维持所要求的合成代谢水平，即菌体生长产品： 柠檬酸（2）厌氧发酵：产生少量能量，大部分养分被分解才能维持合成代谢水平产品：发酵肉食品、乳酸3、发酵过程中菌体生长的阶段？ 停滞期：适应过程，与种子质量、接种量、培养基可利用性、浓度有关对数生长期：适应环境、养分充足稳定期：次级代谢活跃、菌体形态变化死亡期：有害代谢物积累、菌体自溶4、分批发酵、补料分批发酵、连续发酵？（具体见发酵PPT1） 分批发酵：封闭式、出气体流通外发酵液始终留在生物反应器内（操作简单、周期短、不易染菌、基质抑制二次生长现象，不适合抗生素）补料-分批：发酵过
3、程中加入新鲜的料液补充养分，没有输出故体积增加连续发酵：补料、放料速率相近，体积不变，较分批产率高、稳定性好、易自动化5、工业发酵的一般流程是什么？菌种的选育、菌种培养基的配制、扩大培养和接种、发酵过程，下游处理即分离提纯（菌体、代谢产物）第三讲 工业微生物1、常用的发酵工业微生物有哪些？原生生物：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、藻类非细胞型微生物：病毒、噬菌体2、发酵工业对生产菌种的要求？ 产率高 原料要易得、价廉 发酵条件粗放 菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短：感染杂菌的机会减少，提高设备的利用率 尽量诱变次数少，避免选择缺陷型 菌种纯粹，稳定性好 菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题
4、。 抗杂菌能力强，如抗噬菌体 不是病原菌，不产生有害物质和毒素 使用新菌种时更应注意；应用食品领域更需经严格鉴定，早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止3、如何筛选出生产目标产品的菌株？菌株筛选的两个关键问题？（1）从自然界中分离出来就能被利用；对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用；使用重组DNA技术改造的菌株。定方案 采样 增殖 分离 发酵性能测定（2）确定所要分离的微生物类群，并根据其特性选取特定的环境取样；设计筛选培养基4、什么是诱变育种？菌种诱变育种的方法？（1）按照生产的要求，根据生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选、分离而达到菌种诱变选育的目的（2）物理诱
5、变剂：射线如紫外线、X-射线、-射线，快中子,等离子体，超高静压化学因子：如碱基类似物、5氟尿嘧啶、烷化剂等a、出发菌株选择：稳定、高产、对诱变剂敏感、生长周期短b、诱变剂的选择：考虑试验菌株的遗传背景，各种诱变剂有不同的作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在DNA的某些特异部位上复合诱变不易回复突变c、预实验确定诱变条件d、筛选方法：随机筛选：诱变后随机挑选单菌落（制备生长限制因素培养基、避免使用易同化的C/N源会代谢物阻遏、缓冲液维持PH、确定生长辅助因子）理性化筛选：生长因子产生菌（对应于营养缺陷型）的筛选、抗反馈突变株（抗结构类似物）的筛选 高通量筛选：自动化5、什么是菌种保藏？方法有
6、哪些？（1）根据菌种的生理、生化特点，人为地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态。（2）菌种保藏方法：斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、砂土管保藏法、冷冻干燥保藏法、液氮保藏法第四讲 培养基1、什么是培养基？类型和用途？（1）提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物的所需要的，按一定比例配制的含多种营养物质的混合物，提供微生物所需能量，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等。 （2）A.按营养物质来源划分天然：是采用化学成分还不清楚或化学成分还不恒定的各种动植物和动物组织或 生物的浸出物、水解液等物质制成的 合成：用化学成分和数量完全了解的物质配制的半合成培养基：采用一部分天然有机物
7、作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要 B. 按物理性状划分： 固体培养基：适合于菌种和孢子的培养和保存，也用于有子实体的真菌类（香菇、白木耳）的生产 液体：8090%是水，配有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基 半固体：在液体培养基中加入0.50.8%的琼脂，用于鉴定细菌、观察细菌运动特征及噬菌体的效价滴度C按用途划分： 孢子培养基：是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，要求能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，营养不太丰富，常用的有麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基、琼脂斜面培养基 种子
8、培养基：是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮，成为活力强壮的“种子”，一般采用营养丰富且完全的培养基 发酵培养基：供菌体生长、繁殖和合成产物之用，组成除有菌体生长所必需的元素和化合物之外，还要有合成产物所需的特定元素、前体和促进剂等2、工业微生物常用培养基？细菌：牛肉膏蛋白胨培养基细菌7.07.5放线菌：高氏一号培养基7.07.5酵母菌：麦芽汁培养基4.05.8霉菌：查氏培养基4.05.83、营养源的成份及作用，举例？（1）碳源：为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分；为合成目的产物提供所需的碳成分分为：糖类、油和脂肪、有机酸、烃和醇类（2）氮源：用于构成菌体
9、细胞物质和含氮代谢物有机氮源：在微生物分泌的蛋白酶作用下，消解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢，有机氮源营养丰富，还含有少量的维生素和生长因子无机氮源：又称快速氮源，铵盐、硝酸盐和氨水等（3）无机盐及微量元素：组成成分，酶的激活剂，（镁离子还可提高抗生素生产菌对自己所产生抗生素的耐性，许多次级代谢过程对磷酸盐浓度的承受限度比生长繁殖过程低，故必须严格控制）（4）水：良好的溶剂，参与代谢作用中的许多反应，调节细胞的温度 （5）生长因子、前体、产物促进剂和抑制剂：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等，有机氮源（CSL）是生长因子的重要来源；直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结
10、构并没有多大变化（青霉素：苯乙酸、苯乙胺），但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高，前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 ，采用流加的方法；抑制某些代谢途径的进行，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。4、发酵培养基选择的基本原则？l 必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分l 有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率l 有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力l 有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期l 尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化l 原料价格低廉，质量稳定，取材
11、容易l 所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗l 有利于产品的分离纯化，尽可能减少产生“三废”的物质第五讲 灭菌1、什么是灭菌？培养过程中那些需要灭菌？灭菌的方法以及使用的范围？（1）用物理或化学方法杀灭或物料或设备中一切有生命物质的过程（2）培养基灭菌、气体除菌、设备及管道灭菌（3）紫外线：穿透力低，仅用于表面消毒和空气消毒干热灭菌：常用的干热条件为在160下保温1小时，一些要求保持干燥的实验器具和材料等可以用干热灭菌。湿热灭菌：利用饱和水蒸汽进行灭菌。培养基、发酵设备与管理的灭菌以及实验器材的灭菌。121,20-30min（糖溶液会焦化变色、蛋白质变性、
12、维生素失活、醛糖与氨基化合物反应等）对比：细菌蛋白质在有水的情况下易于凝固变性，湿热穿透力强，湿热蒸气有潜热存在，水蒸气凝固成水释放潜热，迅速提高被灭菌物体的温度过滤除菌：利用过滤方法截留微生物，达到除菌的目的。适用于澄清流体的除菌：空气、热敏性培养基组分；产品提取也可利用无菌过滤处理料液，获得无菌产品。化学灭菌，火焰灭菌法，物理方法：超高静压等 分批灭菌：将配制好的培养基放在发酵罐或其它窗口中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。（优点：无需专门的灭菌设备，设备投资少，灭菌效果可靠，对蒸汽要求低（0.20.3MPa），缺点：灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大，操作
13、难于实现自动控制。）连续灭菌：以“高温、快速”为特征的连续灭菌，是将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。（优点：对培养基破坏小，可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量，缺点：蒸汽的要求较高，一般不小于0.45MPa，同时需要一组附加调和，设备投资大）空气的过滤除菌：绝对过滤，深沉过滤排气经碱液处理后排向大气第六讲 种子培养1、种子？指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。2、种子质量要求。种子培养与发酵培养的目的与培养基
14、的差异？（1）纯，活力旺盛，有足够的菌体浓度，要求种子培养至对数生长期中后期（2）菌体生长与繁殖，代谢产物的合成；营养丰富完全，微量元素、前体、促进剂3、接种龄？过于年轻或过老的种子对于发酵的影响？（1）接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间，以菌丝体处于生命力极为旺盛的对数生长期且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适（2）过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵的情况；过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶4、接种量？对发酵的影响？（1）接种量是指移入
15、的种子液体积和接种后培养液体积的比例细菌发酵接种量较小，13%即可，真菌发酵接种量较大，抗生素发酵中大多霉菌的接种量为715%，甚至更高（2）接种量过多，菌丝生长过快，培养液黏度增加，造成溶解氧不足，而影响产物的合成；接种量过小，除了延长发酵周期外，往往还会引起其它不正常情况采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，生产菌迅速占据培养环境，使产物的形成提前到来，减少了杂菌生长的机会第七讲 发酵过程控制1、发酵热的来源？Q发酵 = Q生+ Q搅拌-Q蒸发-Q显- Q辐射生物热：菌体将养分分解氧化获得能量，其中一部分能量用于合成高能化合物，其余部分以热的形式散发出来，这就是生物热。2
16、、温度对发酵过程的影响（1）.从动力学角度来看，T升高，反应速度加快，生长繁殖快，产物提前合成；另一方面，T升高，酶失活愈快，菌体易于衰老，影响产物合成，失活愈快，周期缩短，产物最终产量少。 （2.） 温度通过影响发酵液的物理性质间接影响发酵，影响氧的溶解和传递，影响对基质的分解和吸收速度。 （3.）影响生物合成方向3、菌株的最适温度？最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的合成，产物合成的最适温度与生长温度往往不同。4、pH 对发酵过程的影响？A.Enzymes activities pH变化会引起各种酶活力的改变:影响酶活性中心上有关基团的解离；影响底物（培养基成分）的解离，从而影响酶
17、底物的结合 B.Membrane影响细胞膜电荷，膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄C.影响菌体的生长和产物的合成5、发酵过程中pH变化规律？ 6、如何控制发酵液的pH?Buffer;Ammonia water, urea, NaOH, HCl; 酶制剂、抗生素发酵通过加糖、淀粉来控制pH。7、溶氧的表示方法？百分饱和度？ 百分饱和度是氧浓度表示方法之一,是最常用的方法,培养液被空气完全饱和时,即为溶氧100%饱和度,室温下为7mg/L左右8、临界氧溶度与最适氧溶度？A.指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度, 氧饱和度发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度（发酵过程中维持氧饱和度1）B.
18、 指溶氧浓度对生物合成有一最适范围,有下限,也有上限, 产物的形成和菌体生长的最适溶解氧，常常不一样9、影响溶氧的因素有哪些？如何调节发酵液中溶氧水平？（1）影响C*（氧在水中饱和浓度）：通气量、罐内压力、通气气体成分、温度 影响Kla（发酵液中氧浓度）：养料的丰富程度、发酵液的粘度、搅拌、挡板、表面活性剂 （2）提高罐压,增加C*， 缺点:同时增加二氧化碳的溶解度,影响pH及可能会影响菌的代谢,而且对设备要求高10、基质浓度对发酵过程的影响？过低,菌体生长缓慢,生物合成慢；适中,菌体生长迅速,生物合成快；过高,会抑制菌体生长,引起碳分解代谢物阻遏现象,阻碍产物形成11、发酵过程中泡沫的变化规
19、律？如何控制泡沫？（1）与培养基成分有关:玉米浆,蛋白胨,花生饼粉,黄豆饼粉,酵母粉,糖蜜等是主要的发泡因素；发酵过程中,造成泡沫稳定的蛋白质分解,泡沫减少；发酵后期菌体自溶,可溶性蛋白质浓度增加促使泡沫上升（2）机械法：消沫桨、罐外消泡、罐压加压（节省原材料,减少污染机会,但不能从根本上消除引起稳定泡沫的因素）消泡剂：消泡剂有选择性。消泡剂用多了有毒性，而且还影响通气和气体分散，因此要少量地加第八讲 反应器的设计1、好氧反应器根据反应器通风和搅拌的方式不同可分为？机械搅拌通风式、自吸式、气升式2、通用搅拌式发酵罐的基本要求？发酵罐应具有适宜的高径比。一般高径比为2.54。发酵罐能承受一定的压
20、力。由于发酵罐在消毒和正常工作时，罐内有一定的压力和温度，发酵罐的通风搅拌装置要能使气泡分散细碎，气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧发酵罐应具有足够的冷却面积。发酵灌内应抛光，尽量减少死角，避免藏垢积污，使灭菌彻底，避免染菌。搅拌器的轴封严密，尽量减少泄漏。3、搅拌式发酵罐搅拌器的形式？性能上的比较？（1）平叶、箭叶、弯叶（2）粉碎气泡的能力：平叶 弯叶 箭叶式翻动流体的能力：箭叶式 弯叶 平叶4、夹套与蛇管在传热能力上的差异？ 夹套,传热系数为400-630kJ/(m2h C),5m3以下采用；结构简单，加工容易，罐内死角少，容易清洗灭菌传热壁较厚，冷却水流速低，降温效果差。蛇管,传热系数
21、为1200-1890kJ/(m2h C),5m3以上采用流速大，传热系数大，降温效果较好。冷却水较高时，降温困难，弯曲位置易腐蚀。5、 气升式反应器的形式？气升式反应器与通用式发酵罐的比较与应用？（1） 环流式、塔式、空气喷射式等（2）反应溶液分布均匀；高的溶氧速率和溶氧效率；剪切力小；传热良好；结构简单；能耗小；不易染菌；操作和维修方便；应用：酵母生产、单细胞蛋白生产、细胞培养、酶制剂和有机酸等发酵生产、废水生化处理。6、发酵罐的几何放大计算规则？放大基本手段：用相似原理进行比拟放大，常用的方法；几何尺寸：m = V2/V1；H1/D1 = H2/D2 = A；H2 / H1 = D2 /
22、D1= m1/3空气流量的放大：以Kla=常数的原则进行放大搅拌功率及搅拌转速的放大：采用单位培养液体积通气功率相等的原则第九章 柠檬酸生产1、柠檬酸发酵生产的必要条件？ 糖源浓度高：120250g/L 磷酸盐浓度低:0.2-1.0g/L 氮源用NH4+盐:2.0g/L pH值低:1.6-2.2 溶氧量高: 金属离子浓度极低: Mn2+10-8M;Fe2+10-4M;Zn2+10-20%2、碳源、pH、金属离子的控制与机理？（1）碳源：碳源的种类、浓度是柠檬酸成功生产的最关键因素；碳源浓度对柠檬酸过量生产的调控有影响只有能被真菌快速分解代谢的糖（麦芽糖、蔗糖、葡萄糖）才会有高产率和酸的积累速率
23、；主要原料：甜菜、甘蔗糖蜜高糖浓度原因：低糖浓度导致海藻糖6磷酸的积累，抑制己糖激酶，高浓度解除抑制，通过敲除海藻糖6磷酸合成酶基因可以在低糖浓度下提高柠檬酸的积累量（2）PH：PH小于2.5 柠檬酸才会大量积累低PH的可能原因：葡萄糖氧化酶，如果PH达到4以上，葡萄酸的积累会以柠檬酸为代价。葡萄糖氧化酶为胞外酶，对PH变化敏感，PH100%好氧发酵中NADH中的H与氧气结合产生水，而厌氧发酵中的NADH中H变成终端产物菌体合成少，大量C进入产物第十一讲 抗生素发酵1、抗生素的定义、合成方法及类型 定义： 抗生素（Antibiotics）系指由细菌、真菌或其他微生物在生长过程中产生具有杀灭和抑
24、制病原体的微生物产物，或使用化学方法半合成的衍生物和全合成的仿制品。例如青霉素、链霉素、红霉素等。合成方法：生物合成（微生物发酵）、化学全合成、半合成（将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法引入特定的功能基团进行分子结构改造而制成各种衍生物）类型：1)-内酰胺类(-lactam )：青霉素类、头孢菌素类，包含一个四元内酰胺环2)氨基糖苷类(Aminoglycosides)：链霉素、庆大霉素，既含有氨基糖苷，也含有氨基环醇3）大环内酯类(Macrolides)：红霉素、麦迪加霉素，含有一个大环内酯作配糖体，以苷键和1-3个分子的糖相连4）四环类(Tetracyclines) ：四环素、土霉素，
25、以四并苯为母核5）多肽类(Peptides) ：多粘菌素、杆菌肽，含有多种氨基酸，经肽键缩合成线状、环状或带侧链的环状多肽2、发酵生产过程中温度的控制？pH是如何调节的？ PH：控制0.1，加酸碱加葡萄糖（通过过剩的糖分解代谢产生的乙酸降低PH）泡沫与消沫：少量多次加入消沫剂，在发酵前期不宜多用3、什么是前体？青霉素的前体是什么，加入的目的，如何加入？u 前体：苯乙酸，苯乙酰胺，苯乙酰酯类、醇类等，加入量不能大于0.1%，采用多次加入方式u 参与青霉素的生物合成，构成青霉素的分子结构，当成碳源和能源利用分解u 不同浓度、 pH下对青霉菌的生长、繁殖和生物合成均有毒性，加前体：残余苯乙酰胺浓度控
26、制在0.05-0.08%第十二讲 PHA1.PHAs的分类， PHAs与传统塑料相比具有什么样的优点？组成：单聚PHB、多聚链长：短链（SCL）：包含35个C，刚性强中等长度（MCL）：包含614个C，替代不可降解塑料的理想材料可生物降解，由可再生资源合成2.PHAs的发酵是典型的两步发酵，且需要给予特殊的发酵条件才可大量积累。试从PHAs的产生机理上给予说明？菌体生长、聚合物积累两阶段营养限制条件：除碳源以外的某必需营养受到限制，菌体生长旺盛，养料经代谢大部分用于菌体生长、物质合成，少部分积累聚合物氧气的供给也影响PHAs生产第十三讲 酶的生产与生物转化1、酶的类型 需要加入诱导物才可以产生的酶叫诱导酶 不需加入诱导物就可以产生的酶叫组成型酶 不需加入诱导物就可以产生诱导酶的突变株，叫做组成型突变株（调节性突变）2、生物转化与传统合成相比的优势？专一性、选择性：化学、区域、立体（手性物合成）环保3、L-天冬氨酸转氨酶与D-海因酶、D-N-氨甲酰基氨基酸水解酶的异同？4、使用胞内酶进行转化加入表面活性剂的作用？破坏细胞膜稳定性，使胞内酶释放出来24_