2022年基因工程复习重点 .pdf

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1、学习好资料欢迎下载Southern blotting：即 DNA 印迹杂交，以碱基互补配对为原则，将DNA影印转移与标记探针进行高特异性杂交的方法。Cosmid：黏粒载体， 含有噬菌体的 cos 位点和质粒的复制子， 是专门为克隆大片段设计的载体。cDNA library：利用某种生物的总mRNA 合成 cDNA ，再将这些 cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增称cDNA文库。RACE ：通过反转录和 PCR技术进行 cDNA 末端快速扩增，得到基因转录本的未知序列，从而获得 mRNA 完整序列的方法。RT-PCR ：即逆转录 PCR ，先用逆转录酶作用于mRNA ，以寡聚 dT为

2、引物合成 cDNA第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子的一种方法。MCS ：包含多个限制酶切位点的一段短的DNA 序列。插入失活 ：若把外源 DNA 片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表现特性，此方法叫插入失活。PCR ：是模拟体内 DNA 复制条件，应用 DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA 片段的技术。mRNA差异显示技术：根据真核生物mRNA带有3poly(dA) 的结构，合成poly(dT)12MN 引物与 mRNA 的 3端互补，在反转录酶的作用下合成cDNA mRNA杂交分子。然后合成5随机引物 (10bp) 和 poly(dT)12MN 引物， PC

3、R 扩增获得所有 mRNA 的 cDNA分子。巢式 PCR ：巢式 PCR 使用两对 PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR 引物扩增片段和普通 PCR 相似。第二对引物称为巢式引物 （因为他们在第一次PCR 扩增片段的内部） 结合在第一次 PCR 产物内部，使得第二次 PCR 扩增片段短于第一次扩增。实时荧光定量 PCR ：在 PCR 反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。蛋白质印迹法： 又称免疫印迹法， 在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定基础上发展起来的蛋白质检测技术， 检测蛋白样品中是否存在抗原，也可以评价新抗体的特异性。

4、同裂酶：来源不同的但却具有相同的识别序列，切割 DNA后产生相同末端的一组限制酶星号活性 ：是指在某些条件下，一种特异性识别序列的限制酶在酶切同一种 DNA 片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性。载体：携带外源基因进入受体细胞的工具。转化：重组质粒 DNA 分子导入受体细胞的过程。转染：以噬菌体和真核病毒作载体构建成重组体并导入受体细胞的过程。同裂酶：来源不同的但却具有相同的识别序列，切割 DNA后产生相同末端的一组限制酶同尾酶： 来源不同、识别序列也不同但切割后产生相同的黏性末端的一类酶cDNA ：以 mRNA 为模板反转录出的DNA 。反义 RNA ：是指与 mRNA 互补

5、的 RNA 分子，也包括与其它RNA 互补的 RNA 分子。基因文库 ：指某一生物类型全部基因的集合。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页，共 4 页学习好资料欢迎下载DNA 凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？DNA的相对分子质量大小；琼脂糖浓度；DNA 的分子构象；电源电压；嵌入染料的存在；离子强度的影响。PCR 扩增大量非特异性片段的原因模板：模板中含有杂蛋白质， 模板中含有 Taq 酶抑制剂， 模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。引物：引物质量、

6、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR 失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。酶失活：需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。Mg2+ 浓度：浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。物理原因：如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性 ; 退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。反应体积的改变，循环次数过多等如何提高 PCR 扩增的特异性？1 升高退火温度可增加引物与模板结合的特异性；2. 缩短退火和延伸时间， 可减少错误引发及多余的DNA 聚合酶分子参

7、与酶促延伸的机会；3. 降低引物和酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是能减少引物二聚体的引发；4. 改变 Mg2+ 的浓度可进一步提高扩增的特异性。5. 引物设计的特异性；6. 减少循环次数；Southern bloting的主要步骤1. 待测 DNA 样品的制备、酶切2. 待测 DNA 样品的电泳分离3. 凝胶中 DNA 的变性：碱变性4.Southern 转膜(印迹) ：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法5. 固定6.Southern 杂交(预杂交、杂交、洗膜 ) 7. 杂交结果的检测精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页，共

8、 4 页学习好资料欢迎下载RACE 原理： 通过反转录和 PCR技术进行 cDNA 末端快速扩增，得到基因转录本的未知序列，从而获得 mRNA 完整序列的方法经典 5RACE 操作步骤：以基因特异引物GSP1 作为反转录引物产生cDNA第一链 在脱氧核苷酸末端转移酶的作用下，在cDNA 3 末端加上 Poly （dC ） （或Poly （dA） ）尾 利用锚定引物（ 5OP-IP-oligo （dG ） ） （或 5OP-IP-oligo（dT ） ） 和基因特异引物 GSP1 进行第一轮 PCR扩增 以第一轮 PCR 反应的产物为模板，以基因特异引物GSP2 和内侧引物 IP 进行第二轮 P

9、CR扩增经典 3RACE 操作步骤： 以 mRNA 为模板，用反转录引物合成3端 cDNA第一链，在 5端引入了 OP和 IP 序列 以基因特异引物GSP1 和外侧引物 OP进行第一轮 PCR 扩增 以第一轮 PCR 扩增的产物为模板， 以基因特异引物 GSP2 和内侧引物 IP 进行第二轮 PCR扩增 PCR产物进行直接测序或克隆于适当载体进行序列分析限制性内切酶分类：型限制酶： 能识别专一的核苷酸顺序， 并在识别点附近的一些核苷酸上切割双链，但切割序列没有专一性，是随机的。距离认知位可达数千个碱基之远, 并不能准确定位切割位点，所以并不常用。型限制酶： 能识别专一的核苷酸顺序， 并在该顺序

10、内的固定位置上切割双链。 所认知的位置多为短的回文序列； 所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。型限制酶：有专一的识别序列，但不是对称的回文顺序。限制性内切酶的星号活性产生星号活性的因素： 甘油浓度过高离子强度不适合阳离子的变化溶液中 pH的变化有机溶剂残留的影响影响限制性内切酶活性的因素：DNA的纯度 DNA甲基化程度 DNA的分子结构限制性核酸内切酶的缓冲液酶切消化反应的时间和温度反应体积和甘油浓度质粒与质粒载体（1）特点 : 是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA 分子（2）理想的质粒载体具备条件： 复制子有一个或多个便于

11、检查的遗传标记在非必需区内的DNA 片段内有较多的单一限制性内切酶切位点，便于目的基因的克隆 具备适当的拷贝数具有较高的遗传稳定性蓝白斑筛选原理： 载体上有一段 -半乳糖苷酶基因 （Lac Z） 的片段（氨基端），其上有外源 DNA的插入位点。- 半乳糖苷酶基因 （片段缺失）。可以被 IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的 -半乳糖苷酶。互补而产生的lacZ+ 细菌在诱导剂 IPTG （异丙基 -D-硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal（5- 溴-4- 氯-3- 吲哚-D- 半乳糖苷）存在时产生蓝色沉淀物， 使菌落显蓝色。 如果外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点

12、后，无法实现互补，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 3 页，共 4 页学习好资料欢迎下载重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。（1）基于载体遗传标记检测法：在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。（2）基于克隆 DNA 序列检测法： Southern 印迹杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上， 然后通过与已标

13、记的单链 DNA 探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA 片段。（3）基于外源基因产物检测法：如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记， 或者基因产物与某些药物作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。以gt11 构建 cDNA文库，包装的噬菌体感染大肠杆菌后形成蓝色和无色的两种噬菌斑，请解释其原因。答：现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有 - 半乳糖苷酶基因 （lacZ ）的调控序列和前 146 个氨基酸的编码信息。 在这个编码区中插入了一个多克隆位点 （MCS ） ，它并不破坏读框， 但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不

14、影响功能，这种载体适用于可编码 - 半乳糖苷酶 C端部分序列的宿主细胞。 因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。 由- 互补而产生的 LacZ+细菌在诱导剂 IPTG的作用下，在生色底物 X-Gal存在时产生蓝色菌落， 因而易于识别。 然而，当外源 DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 这种重组子的筛选， 又称为蓝白斑筛选。 如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37温箱倒置培养12-16h 后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。设计一个实验：让猪的生长激素基因在大肠杆菌中表达。答：从基因文库中获取猪的生长基因以提取的基因组为模板，加入引物进行PCR 反应将产物进行胶回收， 回收目的片段将目的片段连入质粒载体将连接产物转化至感受态大肠杆菌中进行阳性鉴定，检测重组质粒是否成功进行自我复制及表达。精选学习资料 - - - - - - - - - 名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页，共 4 页