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1、1 1 （一） WB 相关试剂及常用缓冲液RIPA （100mI ）（最后要调 pH为7.4 ）终浓度分子量称取Tris-HCI(pH7.4) 50mM 121.14 605.7mg NaCI 150 mM 58.44 876.6mg TritonX-100 1% 1mI 脱氧胆酸钠1% 1g EDTA 1 mM 292.248 29.2248mg SDS 0.1% 0.1g PMSF （100mM ）使用时每 1ml 加10ul 10% 过硫酸铵溶液AP （分装保存于 -20 度）AP粉末 1g ddH20 10ml 10SDS （十二烷基硫酸钠）：SDS粉末 10g ddH20 定容到 1
2、00ml 注意：用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡6X蛋白质 sample buffer Tris-HCl(1M,pH6.8) 30mL SDS 10g 甘油 30mL DTT （ 154.25 ） 9.3g 溴酚蓝 0.06g dd H20 定容至 100mL 10XPBS缓冲液的配制： NaCl 80g KCl 2g Na2HPO4 14.4g （十二水合36g）KH2PO40 2.4g 加 800 mLddH2O,根据开始的pH用 NaOH 或 HCL调 pH 到 7.4，调好 pH 再定容到 1 升。配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4 度PBST(1X) PBS(1X) 500ml
3、Tween 20 500l 50Tris-乙酸（ TAE ）缓冲液配制1L 溶液各成分的用量 Tris粉末 242g 冰醋酸 57.1ml Na2EDTA 2H2O 37.2g ddH20 定容到 1L 封闭液名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 17 页 - - - - - - - - - 2 2 脱脂奶粉 5g 叠氮钠 0.02g(现配现用时可不加) PBS 定容到 100mL 染色液 ( 室温 )1L 500ml 200ml 100ml 甲醇500mL 2
4、50 100 50 乙酸100 mL 50 20 10 R250考马斯亮蓝0.5g 0.25 g 0.1 g 0.05 g H20 400 mL 200 80 40 脱色液： ( 室温 )甲醇 165mL 乙酸 50 mL H20 785 mL 8.8Buffer:（调 pH至 8.8, 4 度保存）100ml 200ml Tris 18.17g 36.34g 10%SDS 4mL 8ml ddH20 定容至 100mL 200ml 6.8 Buffer: （调 pH至 6.8, 4 度保存）100ml 200ml Tris 606g 12.12g 10%SDS 4mL 8ml ddH20 定
5、容至 100mL 200ml 转移缓冲液（ 10trans buffer）：（常温保存）1L 2L 甘氨酸144g 288g Tris粉末30.3g 60.6 ddH20 定容至 1L 定容至 2L 使用时甲醇 200mL 转移缓冲液（ 10） 100 mL ddH20 700 mL 电泳缓冲液（ 10） (running buffer)：（常温保存）1L 2L 甘氨酸144g 288g Tris粉末30.3g 60.6 SDS 10g 20g ddH20 定容至 1L 定容至 2L 10)TBS: （常温保存）NaCl 80.0g Tris粉末 24.2g 名师资料总结 - - -精品资料欢
6、迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 17 页 - - - - - - - - - 3 3 ddH20 定容至 1L TBST(1X) TBS(1X) 500ml Tween 20 500 l Stripping buffer(可反复利用 ) 温老师组配方10%SDS 10ml - 巯基乙醇 350l Tris-HCI（pH6.8） 6.25ml（6.06 加到 50mL水）加入 ddH2O 至 50mL Stripping buffer(可反复利用 ) 郭老师给配方甘氨酸 15g SDS 1g
7、 Tween20 1ml dd ddH2O 1L 作这个 buffer洗 20min，然后用 PBST洗 3 次，再重新封闭孵抗体。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 17 页 - - - - - - - - - 4 4 （二）细胞和细菌培养基、抗生素LB培养基 ( 当天灭菌后放4 度存放 ) 1000ml 500ml 300 ml 250 ml 200 ml 氯化钠10g 5g 3g 2.5g 2g 蛋白胨10g 5g 3g 2.5g 2g 酵母提取物5g
8、2.5g 1.5g 1.25g 1g ddH20 定容至1000ml 定容至 500ml 定容至 300ml 定容至 250ml 定容至200ml LB平板：（当天灭菌后倒平板，放4 度存放）1000ml 500ml 300 ml 250 ml 200 ml 氯化钠10g 5g 3g 2.5g 2g 蛋白胨10g 5g 3g 2.5g 2g 酵母提取物5g 2.5g 1.5g 1.25g 1g 琼脂15g 7.5g 4.5g 3.725g 3g ddH20 定容至1000ml 定容至 500ml 定容至300ml 定容至250ml 定容至200ml SOB培养基将下列组分溶解在0.9L 水中：
9、蛋白胨 20g 酵母提取物 5g 氯化钠 0.5g 1mol/L氯化钾 2.5ml 用水补足体积到1L。分成 100ml 的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml 灭过菌的 1mol/L 氯化镁1M IPTG（异丙基硫代 - -D- 半乳糖苷（分子量为238.3 ）溶液IPTG粉末 2.383g ddH20 定容到 10ml 用 0.22 m滤器过滤除菌，分装成1ml 小份贮存于 -20 。Amp+(50mg/ml) Amp+ 粉末 50mg ddH20 1ml 注意：分装保存于-20 度，使用时按1000：1 的比例用Kana+(50mg/ml)Kana +粉末
10、 50mg ddH20 1ml 注意：分装保存于-20 度，使用时按1000：1 的比例用胰酶：抽滤，长期保存可放负20 度粉末 0.25g EDTA 0.02-0.03g 1XPBS 100ml 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 17 页 - - - - - - - - - 5 5 高糖 DMEM 培养基：抽滤保存在4 度粉末全部碳酸氢钠 3.7g ddH20 定容到 1L（用盐酸调pH值到： 7.2-7.4）G418母液（ 100mg/ml）用 0.22
11、M滤菌，分装存于-20 度粉末 1g PBS 10ml zeocin 母液（ 100mg/ml）用 0.22M滤菌，分装存于-20 度粉末 1g ddH2O 10ml Blasticidin（100mg/ml）用 0.22M滤菌，分装存于-20 度粉末 0.3g PBS 10ml 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 17 页 - - - - - - - - - 6 6 （三）利用 His-tag从细菌中纯化蛋白配方透析液配方终浓度母液浓度量取体积Tris-HC
12、l(pH:8.0) 20mM 1M 20ml NaCl 20mM 4M 5 ml MgCl22mM 1M 2 ml DTT 1mM1M 1 ml 甘油50% 500 ml ddH2O472 ml 超声裂解液 (lysis buffer)：2011 年做蛋白纯化时用Na3PO4（164） 8.2g（50mM ）NaCl (58.5) 17.55g（300mM ）加 800 mL ddH2O 溶解， 用 2M NaOH 或者 2M HCL 调 pH 到 8.0，再定容到 1 升。配好后用高压蒸气灭菌后常温保存。洗涤液 (wash buffer)：2011 年做蛋白纯化时用Na3PO4 8.2g （
13、50mM ）NaCl 17.55g（300mM ）咪唑 0.681g（10mM ）加 800 mLddH2O溶解, 根据开始的pH用 2M NaOH 或者 2M HCL调 pH到 8.0 ，调好 pH再定容到 1 升洗脱液 (elution buffer)：2011 年做蛋白纯化时用Na3PO4 8.2g （50mM ）NaCl 17.55g（300mM ）咪唑 17.025g（250mM ）加 800 mLddH2O溶解,根据开始的pH 用 2MNaOH 或者 2M HCL 调 pH 到 8.0 ，调好 pH再定容到 1 升）PrepEase?Histidine-Tagged Protein
14、 Puri?cation Kits - High Speci?city 8X LEW Buffer (Lysis-Equilibrium-Wash Buffer)： （室温保存）pH：8.0NaH2PO4.2H2O 6.2404g（400mM ）NaCl 14.0256g（ 2.4M）dH20 定容到 100 mL （调节 pH：8.0）4X Elution Buffer： （室温保存）pH：8.0NaH2PO4.2H2O 3.1202 g（200mM ）NaC l7.0128g（1.2M）咪唑 6.81 g（ 1M ）dH20 定容到 100 mL（调节 pH：8.0）名师资料总结 - -
15、-精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 17 页 - - - - - - - - - 7 7 EDTA:（ 100mM ） EDTA 2.923 g dH20 定容到 100 mL NiSO4:NiSO4 .6H2O 2.6285g（ 100mM ） dH20 定容到 100 mL 溶菌酶：（使用时1ml 溶液加入 20ul ）粉末 50mg ddH20 1mL 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整
16、理 - - - - - - - 第 7 页，共 17 页 - - - - - - - - - 8 8 (四) 利用 His-tag从细胞中富集蛋白配方磷酸钠缓冲液按图示比例混合0.2 M Na2HPO4溶液和 0.2 MNaH2PO4溶液，得到两种缓冲液，pH分别调节成为8.0 和6.3. pH 0.2 M Na2HPO4体积 /mL 0.2 MNaH2PO4体积 /mL 6.3 11.25 38.75 8.0 47.35 2.65 细胞裂解液 (最好新鲜配制，当天使用)Cell lysis buffer 终浓度配 10ml 配 15ml 配 20ml 配 40ml 配 30ml 盐酸胍 (g
17、) 6M 5.7318 8.5977 11.4636 22.9272 17.1954 Tris(g) 10 mM 0.012114 0.018171 0.024228 0.048456 0.036342 pH 8.0buffer(ml) 100 mM 5 7.5 10 20 15 （注意胍盐是有害试剂注意这里用的磷酸钠缓冲液pH必须 8.0! ）（注意二价阳离子螯合剂，还原剂，会导致镍从树脂上的洗脱）本实验的所有试剂中EDTA 浓度不得超过 1 mM,DTT 浓度不超过 5 mM ，巯基乙醇浓度不超过20 mM 。pH 8.0 的洗脱溶液（最好新鲜配制，当天使用）pH 8.0 的 wash b
18、uffer 终浓度配 100ml 配 50ml 配 20ml 配 40ml 配 30ml Urea 尿素 (g) 8M 48.048 24.024 9.6096 19.2192 14.4144 Tris(g) 10 mM 0.12114 0.06057 0.024228 0.048456 0.036342 pH8.0Na3PO4buffer(ml) 100 mM 50 25 10 20 15 Triton X-100(ul) 0.1% (vol/vol) 100 50 20 40 30 b-mercaptoethanol. 巯基乙醇 (ul) 5 mM 35 17.5 7 14 10.5 pH
19、 6.3 wash buffer (现配现用 ) pH 6.3 的 wash buffer 终浓度100ml 配 50ml 配 30ml pH 6.3 的 wash buffer Urea 尿素 (g) 8M 48.048 24.024 14.4144 Urea 尿素 (g) Tris(g) 10 mM 0.12114 0.06057 0.036342 Tris(g) pH6.3Na3PO4buffer(ml) 100 mM 50 25 15 pH6.3Na3PO4buffer(ml) Triton X-100(ul) 0.1% (vol/vol) 100 50 30 Triton X-100
20、(ul) 注意使用 pH为 6.3的磷酸缓冲液，而且pH不得低于 6，pH要精确配制，非常重要！Histidine的质子化，会导致镍树脂上的解离，所以要精确测定pH，并且以 pH试纸校对，而不是仅仅依靠 pH仪器。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 17 页 - - - - - - - - - 9 9 洗脱溶液200mMImidazole咪唑，5% (wt/vol)SDS，150mM Tris-HCl(pH 6.7) 30% (vol/vol) 丙三醇720m
21、M 巯基乙醇0.0025%(wt/vol)溴酚蓝注意 wt/vol 是质量 /体积之比例，而vol/vol 是体积：体积的比例。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 17 页 - - - - - - - - - 10 10 (五)双向电泳溶液配制水化上样缓冲液（I）：尿素 (8M) 4.805g CHAPS(4%) 0.4g DTT(65mM) 0.098g( 现加 ) Bio-Lyte0.2% （w/v）50I(40% 现加 ) 溴酚蓝 0.001% 10I(
22、1% 溴酚蓝 ) MilliQ 水定容到 10mI, 分装成 10小管， -20度冰箱保存上样缓冲液（ II）：尿素 (7M) 4.2g 硫脲 (2M) 1.52g CHAPS(4%) 0.4g DTT(65mM) 0.098g( 现加 ) Bio-Lyte0.2% （w/v）50I(40% 现加 ) 溴酚蓝 0.001% 10I(1% 溴酚蓝 ) MilliQ 水定容到 10mI, 分装成 10小管， -20度冰箱保存上样缓冲液（ III）尿素 (5M) 3g 硫脲 (2M) 1.52g CHAPS(2%) 0.2g SB 3-10(2%) 0.2g DTT(65mM) 0.098g( 现加
23、 ) Bio-Lyte0.2% （w/v）50I(40% 现加 ) 溴酚蓝 0.001% 10I(1% 溴酚蓝 ) MilliQ 水定容到 10mI, 分装成 10小管， -20 度冰箱保存平衡缓冲液母液尿素 (6M) 36g SDS(2%) 2g Tris-HCI(pH8.8)0.375M 25mI(1.5M) 甘油 (20%) 20mI MilliQ 水定容到 100mI ，分装 10管， -20 度保存胶条平衡缓冲液I（充分混匀，用时现配）胶条平衡缓冲液母液10mI DTT 0.2g 胶条平衡缓冲液II（充分混匀，用时现配）胶条平衡缓冲母液10mI 碘乙酰胺0.25g 低熔点琼脂糖封闭液
24、低熔点琼脂糖 0.5% 0.5g Tris （25mM ）0.303g 甘氨酸 (192mM) 1.44g SDS （ 0.1% ）1mI （10%SDS ）溴酚蓝（ 0.001% ）100I（1%溴酚蓝）MilliQ 水定容到 100mI, 加热溶解至澄清，室温保存名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 17 页 - - - - - - - - - 11 11 （六）同位素实验相关试剂BERreaction buffer（10ml, 分装于 -20度）分子量配
25、10ml 母液称取终浓度Hepes-KOH(pH7.8) 238.31 1M 称2.3831g 0.4mI 40mM KCI 74.55 1.4M 称1.0437g 0.5mI 70mM DTT 154.25 1M 称1.5425g 10I 1mM EDTA 2Na 372.23 1M 称3.7223g 5 I 0.5mM MgCI2 6H2O 203.30 1.4M 称2.8462g 50I 7mM ATP 100mM 0.2mI 2mM ddH2O 8.835mI 2XligaseI activity buffer 终浓度母液配 10ml 取Hepes(pH7.5) 60mM 1M 0.6
26、ml KCl 60mM 1M 0.6ml MgCI2 6H2O 16mM 1M 0.16ml DTT 2mM 1M 0.02ml BSA 200 g/ml 2mg ddH2O 至 10ml 2 X Annealing buffer Tris-HCI(pH7.5-8.0) 20mM NaCI 100mM EDTA 2mM 2X同位素反应buffer(polymerase beta聚合反应 ) 终浓度母液10ml Tris-HCl 100mM(pH8.0) 1M 1ml MgCI2 6H2O 20mM 1M 0.2 ml DTT 4mM 1M 0.04 ml NaCl 40mM 4M 0.4 ml
27、 甘油20% 2 ml ddH2O 至 10ml 2X APE1活力鉴定 buffer 终浓度母液配 10ml Trls-HCL （pH8.0）100mM 1M 1ml KCl 60mM 1M 0.6ml MgCl2 6H2O 10mM 1M 0.1ml 甘油20% 2ml ddH2O 至 10ml 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 17 页 - - - - - - - - - 12 12 同位素电泳上样buffer(2X)(100ml) 终浓度取甲酰胺染
28、料90% 90ml EDTA Na2 30mM 111.669g X 10-2溴酚蓝（ 17kd）0.02% 0.02g 二甲苯蓝0.02% 0.02g 10 X TBE buffer Tris 0.89M 26.945g 硼酸（ pH8.3） 0.89M 13.757g Na2EDTA 20mM 1.86115g 15% Denatured DNA PAGE gel(100ml) 10 X TBE 15ml 40%,19:1 gel stock 37.5ml ddH2O 16ml Urea 48g 存放在 4 度，使用前加200 l 10%AP 和 20 l TEMED 20% Denatu
29、red DNA PAGE gel 10 X TBE 15ml 40%,19:1 gel stock 50ml ddH2O 3.5ml Urea( 尿素 ) 48g 存放于 4 度，使用前取35ml 混合液加 140 l 10%AP 和 140 l TEMED 硼氢化钠（ 1M） 37.83 粉末 0.7566g ddH2O 10ml 2 X dRP buffer（分装保存于负20 度）分子量母液终浓度配 10ml Hepes(pH7.5) 238.31 1M 100mM 1ml MgCl2 6H2O 203.30 1M 20mM 0.2ml KCl 74.55 1M 40mM 0.4ml DT
30、T 154.25 1M 4mM 0.04ml ddH2O 8.36ml 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 17 页 - - - - - - - - - 13 13 DNA binding buffer 终浓度母液分子量配 250ml Tris-HCI(pH8.0) 50mM 1M 12.5 NaCl 100mM 58.3 1.4625g MgCl2 6H2O 10mM 203.3 0.51g Glycerol 10% 25ml NP-40 0.1% 0.2
31、5ml 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 17 页 - - - - - - - - - 14 14 （七）酶切打质谱相关配方NH4HCO3(79.06) 100mM 粉末 0.7906g ddH2O定容到 100ml,pH7.8-8.0 DTT （154.25g ） 100mM 粉末 0.01542g ddH2O 1ml IAA( 碘乙酰胺， 184.96) 200mM 粉末 0.036992g ddH2O 1ml （八）其他配方2XHEPES- 缓冲液（
32、潘老师给的配方做细胞转染，需要调pH为7.05 ，用0.22M滤菌，分装存于 -20 度）。分子量终浓度称取NaCI 58.5 280mM 1.6g KCI 74.55 10mM 0.074g Na2HPO4141.96 1.5mM 0.021g 葡萄糖180.06 12mM 0.21g HEPES 238.31 50mM 1.19g dd H20定容到 80ml CaCI2 2H2O(2M) 147.02 潘老师给的配方做细胞转染粉末 5.88g ddH2O 20ml 0.22m滤菌，分装存于-20 度5XTBS （1L体系）（在利用flag tag 带磁珠的抗体富集蛋白时用）Tris-HC
33、I(250mM) 30.275g NaCI(750mM) 43.875g dd H20 定容至 1L （调节 pH为 7.4）MMS 甲磺酸甲酯（ Sigma 密度为 1.3g/mI,M=110.13）1M 体系：液体 85I ddH2O 915I 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 14 页，共 17 页 - - - - - - - - - 15 15 Hochest 母液： 1mg/ml, 避光存于 -20 度工作液：母液按1:1000 稀释TritonX-100（0
34、.2%）TritonX-100 2l ddH2O 1ml 2 X HDM buffe(II)曾用于 LSD1去甲基化终浓度母液配 10ml 取Tris(pH8.5) 100mM 1M 1ml KCl 100mM 1M 1ml MgCI2 6H2O 10mM 1M 0.1ml BSA 1% 0.1g 甘油5% 1ml ddH2O 6.9ml 100mmol/L PMSF( 苯甲基磺酰氟 ) ：分成贮存于 -20 。PMSF粉末 1.742g 异丙醇 / 甲醇定容到 10ml 【注意】 PMSF 严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了 PMSF
35、，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。5mol/L 氯化钠（ NaCl）：氯化钠 29.2g ddH20 定容到 100ml 2.5 Xgal （5- 溴-4- 氯-3- 吲哚 - 半乳糖苷）： X-gal 25mg 二甲基甲酰胺（DMF ） 1ml 注意：用铝箔包裹装液管，贮存-20 。DEPC （焦碳酸二乙酯）处理水加 100ul DEPC 于 100ml 水中，使 DEPC的体积分数为0.1 。在 37温浴至少12h，然后在 15 psi 条件下高压灭菌20min，以使残余的DEPC 失活。DEPC 会与胺起反应， 不可用 DEPC处理 Tris缓冲液。1mol/L C
36、aCl2溶液在 200ml 蒸馏水中溶解54g CaCl2?6H2O，用 0.22 m滤器过滤除菌，分装成10ml 小份贮存于-20 2.5mol/L CaCl2溶液在 20ml 蒸馏水中溶解13.5g CaCl2?6H2O ，用 0.22 m滤器过滤除菌，分装成1ml 小份贮存于-20 。pH校准液名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 15 页，共 17 页 - - - - - - - - - 16 16 通常称为标液， 现在你买仪器一般厂家都会标配三小瓶粉末：邻苯二甲酸
37、氢钾 （ pH=4.003），混合磷酸盐 （pH=6.864） ， 硼砂（pH=9.182）这需要你把它稀释，一瓶只能兑250 毫升（250C）的纯净水，兑好后摇一摇直到充分溶解（三瓶要分三个瓶子装哦）NaOH(2M) 8g NaOH 粉末定容到100mL HCL(2M) 10mL 11M HCL 溶液定容到110 mL 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 16 页，共 17 页 - - - - - - - - - 17 17 （一） WB 相关试剂及常用缓冲液（ 1-3 页）（二）细胞和细菌培养基、抗生素（4-5 页）（三）利用 His-tag从细菌中纯化蛋白配方（6-7 页）(四)利用 His-tag从细胞中富集蛋白配方（ 8-9 页）(五)双向电泳溶液配制（ 10 页）（六）同位素实验相关试剂（11-13 页）（七）酶切打质谱相关配方（14 页）（八）其他配方（ 14-16 页）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 17 页，共 17 页 - - - - - - - - -