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1、GUS 活性的荧光检测 (protocal) (2007-12-12 11:52:05) 转载分类： 核酸技术3.4.25.2 GUS 活性的荧光检测3.4.25.2.1蛋白的提取及浓度测定(1) 取 100mg植物样品在液氮中研磨成粉末，加入3 倍体积的 GUS 提取缓冲液，再研磨 2min, 将粉末装入 1.5m1 离心管，摇动 5min, 12,000rpm, 40C离心 10min，取上清 4保存备用。(2) 蛋白标准曲线的制作取配制的25ugfmIBSA母液，按下表进行 BSA梯度稀释 : 从中取 4ml 加入 lml 考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置2min, 测定 595nm的光吸
2、收值，制作标准曲线。(3) 样品蛋白含量测定取蛋白上清Sul，加水至 4ml，加入 I ml 考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置 2min, 测定 595nm的光吸收值，根据蛋白标准曲线计算样品蛋白含量。3.4.25.2.2 GUS荧光检测(1) 制作 4-MU标准: 配制 4-MU梯度浓度液 ( 由反应终止液配制 )l0umol/I, 2.5umol/I, lumol/I, 500nmol/I, 100nmol/l, 10nmol/I:在激发光 365nm ，发射光 455nm,狭缝 3nm条件下，测定各样品的荧光值，绘制标准曲线。(2) 酶反应 : 取 40u1 蛋白上清，加入 400ul 反
3、应缓冲液里 (37预热 ) ，立即取100u1加入到 900u1 反应终止液 (0 时的空白对照 ) ，37C 温浴，严格定时， 10min, 30min 和 60min各取 100ul ，加入名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 6 页 - - - - - - - - - 900u1反应终止液。测定荧光值。根据标准曲线，计算各样品酶活。GUS 提取缓冲液 :50mM磷酸钠缓冲液 (PH7.0), lOmMEDTA, 0.1% Triton X-100, O.I
4、%SDS,l Ommp 一疏基乙醇， 4保存。反应缓冲液 :GUS提取缓冲液，加入1MM MUG, 40C 避光保存，可保存2 周。反应终止液 :0.2M Na2CO3, 考马斯亮蓝 G250溶液: 考马斯亮蓝 G250 10mg, 95% 乙醇 5m1, H3PO4IOml ，定容至 l00ml ，过滤后 4保存。25ug/ml BSA: 2.5mg BSA+0.5ml GUS 提取缓冲液，定容至loom, GUS 检测液 50mM 磷酸钠缓冲液 (PH7.0), 0.5MM K3Fe (CN) c, 0.5mM KaFe (CN)。 ，lOmM EDTA, 0.5mg/ml X-Gluc,
5、 40C避光保存3.3.14 GUS 分析GUS 提取缓冲液 :50mM磷酸钠缓冲液 (PH7.0), lOmMEDTA, 0.1% Triton X-100, O.1%SDS, l Ommp一疏基乙醇， 4保存。反应缓冲液 :GUS提取缓冲液，加入1MM MUG, 40C 避光保存，可保存2 周。反应终止液 :0.2M Na2CO3, 考马斯亮蓝 G250溶液: 考马斯亮蓝 G25010mg, 95% 乙醇 5m1, H3PO4IOml ，定容至loom ，过滤后 4保存。25ug/ml BSA: 2.5mg BSA+0.5ml GUS 提取缓冲液，定容至loom, 名师资料总结 - - -
6、精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 6 页 - - - - - - - - - GUS 检测液 50mM 磷酸钠缓冲液 (PH7.0), 0.5MM K3Fe (CN) c, 0.5mM KaFe (CN)。 ，lOmM EDTA, 0.5mg/ml X-Gluc, 40C避光保存GUS 定量检测所需溶液一、Na2HPO4 和 NaH2PO4溶液Na2HPO4.12H2O的分子量： 358.14 NaH2PO4.2H2O的分子量： 156.01 1、200ml 1mol/L Na2H
7、PO4 溶液Na2HPO4.12H2O 71.628g H2O up to 200ml 2、配制 200ml 1mol/L NaH2PO4溶液NaH2PO4.2H2O 31.202g H2O up to 200ml 二、0.1M 磷酸缓冲液 (PH7.0)1mol/L Na2HPO4 28.85ml 1mol/L NaH2PO4 21.15ml H2O up to 500ml 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 6 页 - - - - - - - - - 三、
8、10 SDS溶液在 90ml 水中溶解 10g SDS ，加热到 68助溶，加入几滴浓盐酸调节PH至 7.2 ，然后加水定容至 100ml。四、0.5 M EDTA (PH8.0) Na2EDTA.2H2O的分子量： 372.24 在 80ml 水中加入 18.61g Na2EDTA.2H2O ，用 NaOH 调 PH至 8.0 （约需 2g左右的固体 NaOH ），溶解后定容至100ml。五、GUS 酶提取液0.1M 磷酸缓冲液（ PH7.0） 50ml 10% SDS 1ml 0.5M EDTA(PH8.0) 2ml 甲醇 20ml Triton X-100 100ul -巯基乙醇 100
9、ul ddH2O up to 100ml 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 6 页 - - - - - - - - - 六、GUS 活性检测液（ MUG 溶液） MUG(C16H16O9 4- 甲基伞型酮 - - 葡萄糖醛酸苷 )分子量： 352.3 将 50mg MUG 溶解在 3.548ml 的 GUS 酶提取液中，配制成浓度为 40mmol/L的 MUG 溶液，使用时再稀释到2mmol/L 的工作浓度。或者直接将50mg MUG 溶解到 72ml 的
10、GUS 酶提取液中，配制成2mmol/L 的工作浓度。七、反应终止液（ 0.2 mol/L Na2CO3） Na2CO3分子量： 105.99 配制 500ml 0.2mol/L的 Na2CO3溶液： Na2CO3 10.6g H2O up to 500ml 八、4-MU溶液配制 4-MU（4-甲基伞型酮）分子量： 176.2 称 0.14096g 4 -MU 固体溶于 40ml 反应终止液（ 0.2M Na2CO3）中，配制成 20mM 的 4-MU溶液。然后再稀释到1mM 浓度，贮存于 20 度，留待制备 MU 标准曲线。GUS 定量检测操作步骤名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 -
11、 - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 6 页 - - - - - - - - - 一、标准曲线的制备用反应终止液将 MU母液（ 1mM ）稀释成浓度范围在010uM的系列标准液，通过测定它们的荧光强度作出一条标准曲线。二、GUS 酶提取、测定方法：1、取 0.1g 材料于 1.5ml 离心管中，加入液氮，研成粉末，加 600ul 酶提取液。2、 13000rpm 4 离心 10min，取上清3、取适量的上清，用考马斯亮蓝法测定蛋白的含量。4、取 50ul 含 GUS 的上清（可根据测定的蛋白含量进行适当的
12、调整体积）加入到 450ul 在 37预热的检测液（ 2mmol/L MUG 溶液）中。迅速充分混匀，并立刻取出 50ul 加入到 950ul 反应终止液（ 0.2mol/L Na2CO3），将该管作为酶促反应的 0 点。5、然后分别在 5min、10min、20min、30min、45min 和 60min 分别取出 50ul的反应液，转入 950ul 的反应终止液中。6、用荧光分光光度计在激发波长365nm 、发射波长 455nm下，测定不同时间点的荧光值。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 6 页 - - - - - - - - -