《2022年DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 .pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 .pdf（24页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、1 DNA重组、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化DNA 重组DNA 重组（基因重组）是指，由不同DNA链的断裂和连接而产生 DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。 受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA 片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。通过噬菌体媒介， 将供体细胞DNA 片段带进受体细胞中， 使后者获得前者的部分遗传性状的现象， 称为转导。自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂
2、时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组。基因重组是杂交育种的生物学基础，对生物圈的繁荣昌盛起重要作用， 也是基因工程中的关键性内容。基因工程的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA 分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA ，并将其导入到受体中（微生物或高等动植物），从而使受体获得某些有益性状。1977年美国科学家首次用重组的人生长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。 此后，运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - -
3、 - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 24 页 - - - - - - - - - 2 质粒把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术 , 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 (Vector)。YAC 、BAC 、噬菌体、细菌质粒等是重组DNA 技术中常用的载体。 一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性： （1）分子量小、多拷贝、松驰控制型； （2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源 DNA片段； （4）具有容易操作的检测表型。质粒 (Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子, 大小从1-200kb 不等 , 为双链、闭环
4、的DNA 分子, 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力, 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数, 并表达所携带的遗传信息。 质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活, 而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性, 如对抗生素的抗性等。F 质粒( 又称 F 因子或性质粒 ) 、R质粒( 抗药性因子 ) 和 Col 质粒( 产大肠杆菌素因子) 等都是常见的天然质粒。质粒载体 是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比, 质粒载体通常带有一个或一个以上的选择
5、性标记基因( 如抗生素抗性基因) 和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列, 并去掉了大部名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 24 页 - - - - - - - - - 3 分非必需序列 , 使分子量尽可能减少, 以便于基因工程操作。 大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列, 这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA 、体外转录外源 DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。常用的质粒载体大小一
6、般在1kb 至 10kb 之间，如 PBR322 、PUC系列、 PGEM 系列和 pBluescript（简称 pBS ）等。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单 , 质粒要比其它任何载体都要好。本实验中应用T 载体转化受体菌E. coli DH5的菌株。由于 T 载体上带有 Ampr 和 lacZ 基因, 故重组子的筛选采用Amp抗性筛选 与- 互补现象 筛选相结合的方法。因 T 载体带有Ampr （氨苄青霉素耐受）基因, 故转化受体菌后只有带有 T载体 DNA的转化子才能在含有Amp（氨苄青霉素）的 LB 平板上存活下来 ;而未获得转化的空细
7、菌则不能存活。此为初步的抗性筛选。T 载体上带有 - 半乳糖苷酶基因 (lacZ) 的调控序列和 - 半乳糖苷酶N端 146 个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点, 但并没有破坏lacZ的阅读框架, 不影响其正常功能。E. coli DH5菌株带有 - 半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, T载体和 DH5编码的 - 半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在 T载体和 DH5融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - -
8、 - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 24 页 - - - - - - - - - 4 半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫- 互补。由 -互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal (5- 溴-4氯-3- 吲哚 -D- 半乳糖苷 ) 的存在下被 IPTG( 异丙基硫代 - -D-半乳糖苷 ) 诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到T 载体质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活 , 产生的氨基酸片段失去 -互补能力 , 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在 LB培养基上，-
9、互补产生的 Lac+细菌由于含 - 半乳糖苷酶，能分解LB培养基中的X-gal ，产生蓝色菌落，而当外源片段插入后，失去-互补能力，因而不产生- 半乳糖苷酶，无法分解培养基中的X-gal ，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为 - 互补现象筛选 。注：X-gal 是 5-溴-4- 氯-3- 吲哚-b-D- 半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside）以半乳糖苷酶（ b-galactosidase）水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside） ，为非生理性的
10、诱导物，它可以诱导 lacZ 的表达。连接策略外源 DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：（1）带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理质粒和外源片段，即可得到这样名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 24 页 - - - - - - - - - 5 的末端。 但是在连接反应中值得注意的是，由于质粒和外源片段本身可能含有两个相同粘性末端，因此均可能发生质粒的自身环化或外源片段形成的寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须在实验方案中尽可能保证正
11、确连接产物的数量达到最高，同时需进行后续阳性克隆的筛选。（2）带有非互补粘性末端用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端 , 这也是最容易克隆的DNA 片段，一般情况下 , 常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在 DNA 片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。（3）带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由 DNA聚合酶补平所致。 由于在连接反应中， 平端的连接效率比粘性末端要低得多， 故使用 T4 DNA 连接酶
12、的浓度和外源DNA及载体 DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进 DNA 分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下， 外源 DNA 分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配 , 则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头 (linker)或衔接头 (adapter)使其匹配 , 也可以有控制的使用 E. coli DNA 聚合酶的 klenow 大片段部分填平3 凹端,名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，
13、共 24 页 - - - - - - - - - 6 使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。转化转化(Transformation)是将外源 DNA分子引入受体细胞 , 使之获得新的遗传性状的一种手段, 它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞 一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M), 它可以容忍外源 DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法 ( 如电击法 ,CaCl2 ,RbCl 等化学试剂法 ) 的处理后 ,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变, 成为能允许外源DNA分子进
14、入的感受态细胞 (Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制 , 表达实现遗传信息的转移, 使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子 (Transformant,即带有异源 DNA 分子的受体细胞 )。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和 RbCl(KCl) 法，RbCl(KCl) 法制备的感受态细胞转化效率较高, 但 CaCl2法简便易行 , 且其转化效率完全可以满足一般实验的要求, 制备出的感受态细胞暂时不用时, 可加入占总体积15的无菌甘油于 -70保存 (半年 ), 因此 CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效
15、率, 实验中要考虑以下几个重要因素：（1）细胞生长状态和密度: 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 24 页 - - - - - - - - - 7 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20 甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化效率。（2）质粒的质量和浓度: 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比, 但当加入的外源 DNA量过多或体积过大时, 转化效率就会降低。一般
16、情况下， 1ng 的 DNA即可使 50l 的感受态细胞达到饱和，同时DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。（3）试剂的质量 : 所用的试剂 , 如 CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或 AR.), 并用超纯水配制 , 最好分装保存于干燥的冷暗处。（4）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿、离心管等需经高压灭菌处理, 所有的试剂都要灭菌或过滤除菌, 且注意防止被其它试剂、 DNA 酶或杂 DNA 所污染。本实验方案本实验以 E.coli DH5a菌株为受体细胞 , 并用 CaCl2处理, 使其处于感受态（本实验购买了商品化的感受态）, 然后与 pBS
17、质粒共保温 , 实现转化。由于pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ) ，可通过 Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 24 页 - - - - - - - - - 8 pBS ，则在含 Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS 。带有插入片段的转化子由于破坏了半乳糖苷酶基因, 呈白色 ; 不带外源片段的转化子可以分解X-gal ，呈兰色。将白色转化子挑出后扩大培养，
18、PCR鉴定后进一步酶切鉴定。一、试剂材料及设备试剂：X-gal 储液(20mg/ml) ，IPTG储液(200mg/ml) ，LB液体培养基， 0.1mol/L的 CaCl2溶液，Amp母液，含 Amp的 LB固体培养基 ， 含X-gal和IPTG 的 筛 选 培 养 基 ， pMD18-T vector ；注：具体配方见实验六后附录材料：外源 DNA 片段: PCR 纯化回收产物， 载体 DNA pBS质粒 (Ampr ,lacZ)，E. coli DH5菌株 R,M,Amp；设备： 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱， 电泳仪， 无菌工作台，微量移液枪
19、，eppendorf 管，低温冰箱 , 制冰机 , 分光光度计二、实验步骤及注意事项（一）连接反应1、样品混匀冰上溶解 solution I、vector及重组 DNA片段等，涡旋混匀并短暂离心。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 24 页 - - - - - - - - - 9 2、配制连接体系按下列顺序在加入各种成分, 建立连接反应。成分体积vector 0.5 l 纯化产物4.5 l Total 5l 注：纯化产物的使用量0.1pmol-0.3pmol
20、；3、 加入 Solution I Solution I的体积为 5l ，轻轻吹吸混匀。4、 连接反应 16连接 30min（水浴或 PCR 仪进行）。（二）感受态细胞的制备 ( CaCl2法) 1、 受体菌的培养从 LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落 , 接种于 5ml LB液体培养基中 ,37 下振荡培养12 小时左右（过夜）, 直至对数生长后期； 将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于50ml LB液体培养基中 ,37 300 转振荡培养 3 小时至 OD600 0.5左右。2、 收集菌体将 5ml培养液转入预冷的离心管中, 冰上放置 10分钟 , 然后于4下 40
21、00 转离心 10 分钟。3、 CaCl2悬浮细胞，制备感受态名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 24 页 - - - - - - - - - 10 弃上清，用预冷的 0.1mol/L的 CaCl2溶液 1ml 轻轻悬浮细胞 , 4下 4000r/min 离心 10 分钟。弃去上清 , 倒出培养液，将管倒置几秒钟以使最后残留的痕量培养液流尽。加入 0.2ml 预冷 0.1mol/L的 CaCl2 溶液, 轻轻悬浮细胞 , 转入1.5ml 离心管，冰上放置20
22、分钟, 即成感受态细胞悬液。4、 感受态细胞冻存3 中用含 15% 甘油的 0.1mol/L的 CaCl2 溶液代替普通预冷CaCl2 溶液，重悬细胞 , 即可贮存于 -70可保存半年。使用时从 -70冰箱中取出感受态细胞悬液, 室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。( 三) 转化1、混合冰上迅速解冻感受态细胞，取 50l + 重组 DNA5 l，用手指轻弹混匀；置于冰上，静置30min，使二者充分结合；注：1）解冻感受态细胞，动作要快；以免影响细胞转化效率；2）重组 DNA 质粒解冻后，混匀，瞬间离心再取；3） 质粒含量不宜过多， 一般不超过 50ng， 体积不超过 10l；4）感受态细胞和DN
23、A 混匀时不要用枪吹打， 以免影响细胞转化效率；2、热击42水浴，热击45 秒, 后迅速置于冰上冷却2-3 分钟，过程中名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 24 页 - - - - - - - - - 11 不要摇动离心管。注： 1）热击操作使DNA进入感受态细胞；2）不同感受态细胞，热击时间亦有所不同；3）冰上迅速冷却，使得DNA在感受态中稳定；3、菌的增殖加入不含抗生素（ Amp ）的 LB液体培养基 500l 混匀， 37振荡 1 小时（转速为200
24、转/ 分） 。注：此步骤主要是为了使细菌恢复正常生长状态, 并表达质粒编码的抗生素抗性基因。4、铺板取 100l 的菌液加到含Amp及 IPTG（4ul ）/X-gal （40ul ）的筛选平板上， 用涂布棒小心涂布均匀；室温正置 1 小时左右， 使菌液完全被培养基吸收；注：1）含 Amp及 IPTG/X-gal 的筛选平板需要事从冰箱中取出，倒置，使之恢复室温；2）涂布的菌液量要适当，以免形成的菌落密度过密或过稀，不利于后续挑菌。5、过夜培养倒置培养皿 ,37 培养箱中静置培养过夜。注： 1）倒置培养是防止冷凝水浸润到培养基中；2）静置培养时间不宜过长，时间过久会出现“卫星菌落”。附录：试剂
25、配方名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 24 页 - - - - - - - - - 12 1、 X-gal储液 (20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成 20mg/ml 的储液 , 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20。2、IPTG 储液 (200mg/ml): 在 800l蒸馏水中溶解200mg IPTG 后, 用蒸馏水定容至1ml, 用 0.22 m滤膜过滤除菌，分装于eppendorf 管并储于 -20。3、含 X-ga
26、l 和 IPTG的筛选培养基：在事先制备好的含50g/ml Amp 的 LB平板表面加40l X-gal储液和 4lIPTG 储液 ,用无菌玻棒将溶液涂匀, 备用。 4 、Amp母液：配成 50mg/ml 水溶液 , -20 保存备用。 5 、 含 Amp的 LB固体培养基 : 液体培养基中每升加15g 琼脂粉 , 高压灭菌。冷却至 60左右 , 加入 Amp储存液 , 使终浓度为 50ug/ml, 摇匀后铺板。 6 、0.1mol/L的 CaCl2溶液: 溶于重蒸水中 , 定容后过滤灭菌。 7 、LB 液体培养基 (20g/L) ：LB 固体粉末20g，加入 1L自来水，溶解后高压灭菌。 8
27、 、质粒重组试剂盒：pMD18-T vector （TaKaRa ）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 24 页 - - - - - - - - - 13 实验七重组克隆的蓝白斑筛选名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 24 页 - - - - - - - - - 14 一、材料与试剂试剂：含重组 DNA片段的 E. col
28、i DH5菌株， Amp母液（ 50mg/ml 水溶液），LB液体培养基， PCR试剂盒仪器：牙签、恒温摇床， 台式高速离心机， 恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪，无菌工作台，微量移液枪， eppendorf 管，低温冰箱二、实验步骤与注意事项1、阳性克隆筛选取过夜倒置培养的平板，观察平板：是否出现明显而又未相互重叠的单菌落注：1）如果未出现菌落或菌落较小，可以延长培养时间。2）在含 X-gal 和 ITPG的 LB培养基上，带有插入片段的重组质粒转化子，应呈现白色菌落，因为插入片段破坏了原载体中 - 半乳糖苷酶活性；带有空载体的转化子，由于具有 - 半乳糖苷酶活性 ,
29、为蓝色菌落；不带有质粒载体 DNA的细胞 , 由于无 Amp抗性, 不能在含有Amp的筛选培养基上成活。2、挑阳性菌用牙签随机挑取白色重组菌，沾至含有Amp抗生素 1ml 液体 LB培养基中， 37 度培养过夜（转速200 转/分） 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 14 页，共 24 页 - - - - - - - - - 15 3、菌落 PCR 1）菌液模板的获取取 0.2ml 过夜培养的菌液于1.5ml 离心管中，沸水浴5 分钟。12000rpm，离心 3 分钟
30、。2）配制 PCR 体系 25l模板：取 2l上清作为模板；引物： pGE-T Vector 多克隆位点两侧的序列；或从基因组中扩增出片段时所用的引物。反应体系：组分（工作浓度） 体积终浓度10 Buffer 2.5 l 1dNTP(10mM) 0.5 l 200M引物（上下游2.5 M）2l0.2 M菌液2l100ng Taq(5U/ l)0.25 l 1.25U 灭菌 ddH2O 补齐25l名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 15 页，共 24 页 - - - - -
31、 - - - - 16 3）PCR 反应条件94预变性 2 分钟94变性 30 秒57退火 30 秒28 cycles 72延伸 30 秒72延伸 5 分钟4）电泳取 10l PCR产物，加入上样缓冲液， 1.5%琼脂糖电泳检测插入片段的大小是否与目的基因一致。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 16 页，共 24 页 - - - - - - - - - 17 实验八质粒 DNA 的提取、酶切及电泳检测质粒 DNA的提取与电泳基本步骤培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细胞
32、; 分离和纯化质粒DNA 。实验原理名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 17 页，共 24 页 - - - - - - - - - 18 采用十二烷基磺酸钠(SDS) 或 Triton X-100可使细胞膜裂解。经 SDS或 Triton X-100处理后 , 细菌染色体 DNA会缠绕附着在细胞碎片上 , 同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多 , 易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性, 而共价闭合环状D
33、NA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起, 质粒 DNA双链又恢复原状 , 重新形成天然的超螺旋分子, 并以溶解状态存在于液相中。电泳检测在细菌细胞内 , 共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA 。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂, 分子就能旋转而消除链的张力, 形成松驰型的环状分子, 称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒 D
34、NA 的两条链在同一处断裂, 则形成线状DNA(Linear DNA) 。当提取的质粒DNA电泳时 , 同一质粒 DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。酶切鉴定限制性内切酶名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 18 页，共 24 页 - - - - - - - - - 19 能特异地结合限制性酶识别的DNA 序列之内或其附近的特异位点上 , 并切割双链 DNA 。如 EcoR 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5,G AATTC,3 5, GAAT
35、TC,3 3,CTTAA G 5 3, CTTAA G,5 酶切反应影响因素DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响酶切反应的效率。DNA ：大部分限制性内切酶不受RNA或单链 DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时, 会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时, 每次都要用新的吸管头。缓冲液：如果采用两种限制性内切酶, 必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液, 则可同时水解。若需要不同的盐浓度 , 则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用, 随后调节盐浓度 , 再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/ 氯仿抽提，加
36、0.1 倍体积 3mol/L NaAc和 2 倍体积无水乙醇，混匀后置- 70低温冰箱 30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。酶切图谱DNA 限制性内切酶酶切图谱又称DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在 DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 19 页，共 24 页 - - - - - - - - - 20 基因文库的构建等工作中，建立限制性
37、内切酶图谱都是不可缺少的环节， 近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性) 技术更是建立在它的基础上。在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA 用量约为 0.5-1 g。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同, 各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度( 大多数为37)。对质粒DNA酶切反应而言 , 限制性内切酶用量可按标准体系 1g DNA加 1 单位酶 , 消化 1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量 , 一般增加 2-3 倍, 甚至更多 , 反应时间也要适当延长。一、试剂1、溶液： 50 mmol/L 葡萄糖， 25 mmol/L Tris.Cl (pH8
38、.0) ，10mmol/L EDTA (pH8.0) 。 溶液可成批配制 , 每瓶 100ml, 高压灭菌(6.895*104Pa)15分钟, 储存于 4冰箱。2、溶液： 0.2 mol/L NaOH (临用前用 10mol/L NaOH 母液稀释) ，1 SDS。3、溶液： 5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml ， H2O 28.5ml ，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac5mol/L 。4、RNase酶 10mg/ml 5、STE ：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris Cl(pH8.0) ，1mmol/L EDT
39、A (pH8.0) 。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 20 页，共 24 页 - - - - - - - - - 21 二、实验步骤与注意事项1、接菌用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基 ( 含 50g/ml Amp) 中,37 振荡培养约 12 小时至对数生长后期。后续步骤 2-4 为质粒 DNA 少量快速提取（碱法）该方法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样, 所得 DNA 有一定纯
40、度 , 可满足限制酶切割、电泳分析的需要。注：提取过程保持低温稍好。2、菌体的收集取 5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf管中( 多次离心在同一管中进行，将沉淀一并收集), 12000g离心 30 秒。弃上清 , 将管倒置于卫生纸上数分钟 , 使液体流尽。注：菌液量要适当，太少可能无法保证后续实验要求，太多会使裂解提取步骤不够充分。3、 菌体裂解（1）洗涤菌体用 1ml STE 重悬洗涤菌体，离心，12000g 离心 30 秒，收集菌体。重复用 STE漂洗菌体。注：洗涤的目的在于除去培养基中菌株细胞壁成分，以免其抑制限制性内切酶的活性。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 -
41、 - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 21 页，共 24 页 - - - - - - - - - 22 （2）加入溶液 I 使菌体充分裂解菌体沉淀重悬浮于200l 溶液中，剧烈振荡，使菌体充分裂解。（3）加入溶液变性DNA 加入新配制的溶液300l ，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管 6-8 次，此时溶液变澄清；冰浴5 分钟。溶液 II 1ml的配制： 20ul 10N NaOH + 100ul 10%SDS + 880ul 水注： 1）混匀操作要快，以免局部碱浓度过高； 2）混匀操作要温和， 不能剧烈震
42、荡， 以免损伤质粒DNA ； 3）应确保整个离心管的内表面均与溶液接触并混匀内容物 (千万不要振荡 ) 。（4）加入溶液质粒DNA 复性加入300 l预冷的溶液，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管 6-8 次，此时管内出现白色絮状沉淀。冰浴中 10 分钟。 4下 12000g 离心 5-10 分钟。注：混匀操作也要温和和迅速。 4、分离纯化质粒DNA （1）收集上清取上清 600l 于新离心管中。（2）RNase酶消化加入 10l 10mg/ml RNase酶溶液， 37消化 RNA 20分钟。（3）酚- 氯仿抽提 DNA 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - -
43、 - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 22 页，共 24 页 - - - - - - - - - 23 分别加入等体积的酚和氯仿（各300l ） ，在涡旋混合器上振荡几秒。 12000rpm 4 离心 10 分钟，取上清。注：此步骤用于除去体系中的蛋白质。（4）沉淀质粒加入 2 倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20 度放置 30 分钟；12000rpm 4 离心 30 分钟，弃上清。注：沉淀 DNA 可使用 2 倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇。（5）洗涤质粒加入 600l 75 乙醇，洗涤沉淀，12000rpm 4离心 10 分
44、钟，弃上清，室温晾干。（6）溶解质粒沉淀用 10l ddH2O溶解，进行酶切鉴定或20保存备用。 5 、酶切反应：（1）酶切体系 20ul 在 PCR 小管中加入：质粒DNA 10l，10 Buffer（M） 2l，EcoRI 1 l，Hind 1l，灭菌水 6l。混匀离心。注：1）不同的限制性内切酶对应不同的酶反应缓冲液；使用双酶切时，如果两个酶所要求的缓冲液不同，可以先做单酶切，名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 23 页，共 24 页 - - - - - - - -
45、 - 24 凝胶回收后做另一酶切，但此种方法损失的样品较多；通过查阅说明书，选择两个酶都合适的缓冲体系（两种酶在其中都能高效运作），本实验即属于此类。2）酶切体系，中酶的量不超过体系的十分之一，吸取时注意避免枪头外壁附着过多酶量。（2）酶切反应37保温过夜。（3）电泳检测跑 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。 6 、测序及同源性分析 PCR筛选及酶切鉴定所得的阳性克隆子一般交由公司测序，测序结果提交 GenBank进行同源性分析。同源性分析如果显示测序结果与我们在设计PCR引物时所用的目的序列相同或有较高的同源性，才能真正证明我们一系列的工作的正确：从提取核酸，到PCR反应，纯化，克隆等。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 24 页，共 24 页 - - - - - - - - -