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1、基因工程的基本操作程序n（1）目的基因的获取）目的基因的获取n（2）n（3）将目的基因导入受体细胞）将目的基因导入受体细胞n（4）目的基因的检测与鉴定）目的基因的检测与鉴定基因基因表达载体表达载体的构建的构建一、目的基因的获取1.什么叫基因文库？什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到片断，导入到中中，各个受体菌分别含有这种生物的不，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。同基因，称为基因文库。基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（cDNA文库）文库）基因组文库的构建模式图通过对通过对受体菌受体菌的培养的
2、培养而储存而储存基因基因基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较基因组基因组文库与文库与部分基部分基因文库因文库的关系的关系小小大大无无有有无无有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因 某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子 RNARNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，聚合酶能
3、够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。并与其结合。 转录开始后，转录开始后，RNARNA聚合酶沿聚合酶沿DNADNA分子移动，分子移动，并以并以DNADNA分子的一条链为模板合成分子的一条链为模板合成RNARNA。 转录完毕后，转录完毕后，RNARNA链释放出来，紧接着链释放出来，紧接着RNARNA聚合酶也从聚合酶也从DNADNA模板链上脱落下来。模板链上脱落下来。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能能 编码蛋白质编码蛋白质 编编码码区区非非编编码码区区原原核核细细胞胞的的 基基因因结结构构有调控遗传
4、信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子补：真核细胞的基因结构补：真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子启动子终止子终止
5、子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子： 外显子：外显子： 真真核核细细胞胞的的 基基因因结结构构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子：能编码蛋白质的序列子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的包括位于编码区上游的RNARNA 聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非非编码序列：编码序列： 包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子结构基因结构基因外显子外显子内含子内含子转录、加工修饰转录、加工修饰mRNA原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_
6、的的编码区是间隔的编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由都由能够编码蛋白质的能够编码蛋白质的_ _ _ 和和具有调控作用的具有调控作用的_ 区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码DNAmRNA蛋白质蛋白质转录转录翻译翻译基因文库与基因库 基因库是指某一生物群体中的全部基因。 基因文库与基因克隆基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆，建成
7、后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。 依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列；如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能；基因的功能； 基因在染色体上的位置；基因在染色体上的位置； 基因的转录产物基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。基因翻译产物蛋白质等特性。u基因文库基因文库中不是直接保管相应基因，中不是直接保管相应基因，而是而是保存受体菌保存受体菌，菌中含基因。，菌中含基因。2.2.提取目的基因的方法提取目的基因的方法（1 1） 鸟枪法鸟枪法（2 2） 反转录法反转录法（3 3）直接分离法直接分离法（1 1）鸟枪法：）鸟枪法：供体细胞中的
8、供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶与载体连接与载体连接受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离( (直接分离法直接分离法) ) 以目的基因转录成的以目的基因转录成的信使信使RNA为模板，为模板，再再反转录酶反转录酶的催化下反转录成互补的单链的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在，然后在DNA聚合酶的作用下合成双聚合酶的作用下合成双链链DNA，即，即cDNA，从而获得所需的基因。，从而获得所需的基因。（2 2）反转录法（）反转录法（cDNAcDNA文库的构建方法文库的构建方法）上述三种目的基因
9、提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，工作量大，盲目，分离出来的有时并分离出来的有时并非一个基因非一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要很不稳定，要求的技术条件较高求的技术条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸仅限于合成核苷酸对较少的简单基因对较少的简单基因1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复
10、13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。 前提条件：前提条件：_； 原料：原料：_、_ _ 、 _、 _。原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNADNA引物引物热稳定热稳定
11、DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板模板DNADNA过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端延伸，合成与模板互补端延伸，合成与
12、模板互补 的的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链n 过程：过程：变性、退火、延伸三步曲变性、退火、延伸三步曲变性：变性：加热至加热至90909595双链双链DNADNA解链成解链成为单链为单链DNADNA退火：退火：冷却至冷却至55556060部分引物与模部分引物与模板的单链板的单链DNADNA的特定的特定互补部位相配对和互补部位相配对和结合结合延伸：延伸：加热至加热至70707575以目的基因为以目的基因为模板，合成互补的模板，合成互补的新新DNADNA链链变性变性退火退火延伸延伸模板DNA95PCRPCR的基本原理的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点
13、50引物1引物2DNA引物PCRPCR的基本原理的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCRPCR的基本原理的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第1轮结束第2轮开始PCRPCR的基本原理的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCRPCR的基本原理的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理nPCR反应条件nPCR过程nPCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩
14、增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 思考？思考？1 1个个DNADNA分子进行分子进行PCRPCR扩增扩增, ,循环循环4 4次，次，理论上至少需要几个引物？理论上至少需要几个引物？2（2n-1）(n为循环次数为循环次数)（24-1）2=30PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性90-95C延伸延伸70-75C退火退火55-60CPCRPCR总结：总结：n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分一对寡核苷酸序列：与目的基
15、因一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补的起始段互补PCRPCR总结：总结：PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCRPCR技术技术DNADNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在高温下在高温下变性解旋变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNADNA聚合酶聚合酶 细胞内的细胞内的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整个形成整个DNADNA分子分子 根据已知蛋白质根据
16、已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的出相应的mRNAmRNA序列，序列，然后按照碱基互补配然后按照碱基互补配对原则，推测出它的对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合以单核苷酸为原料合成目的基因成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成（三）化学方法人工合成目的基因（三）化学方法人工合成目的基因n从基因文库中获取从基因文库中获取n利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增n利用化
17、学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法 用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。 用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶1.1.过程过程: :二、构建表达载体 核心核心质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一
18、个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种过程过程: :2.2.基因表达载体的目的基因表达载体的目的（1 1）使目的基因在受体细胞中稳定存在）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；并可以遗传给下一代；（2 2）使目的基因能够表达和发挥作用。）使目的基因能够表达和发挥作用。 科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因插入载插入载体质粒中，然后导
19、入棉花的受精卵中，结果抗体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子启动子( (抗虫基因首端抗虫基因首端) )，导入棉花受精卵，长成的棉，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入子、抗虫基因的质粒中插入终止子终止子( (抗虫基因末抗虫基因末端端) )，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。抗虫能力。 作为基因工程表达载体，作为基因工程表达载体，只需
20、含有目的基因就可以完成任务只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（吗？为什么？（P P1515） 不可以。不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，达并发挥作用，还需要有其他控制元件还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的必须构建上述元件的是：是：（1 1） 生物之间进行基因交流，只有使用生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自受体生物自身基因身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；（2 2） 通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只文库
21、获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；将编码序列导入受体生物中无法转录；（3 3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4 4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置何位置( (上游或下游上游或下游) )上都发挥作用。上都发挥作用。）等；等；（5 5） 有时需要确定目的基因表达的产
22、物存在于细胞的有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。基因等。3.3.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？它们有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因调节基调节基 因因操纵基操纵基 因因结构基因结构基因RNA聚合酶聚合酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶 酶酶 酶酶 RNA聚合酶聚合酶启动子启动子RNA聚合酶聚合酶启动子启动子：位于基因首
23、端的一段特殊的位于基因首端的一段特殊的DNA片断，片断，它是它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。，最终获得蛋白质。思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？n（1 1）生物之间进行基因交流，只有）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；有利于基因的表达；n（2 2）通过）通过cDNAcDNA文库获得的目的基因文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。细胞无法转录。思考思考2：终止子
24、的作用是什么？终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特终止子是位于基因尾端的一段特殊的殊的DNA片断，能终止片断，能终止mRNA的转录的转录。 是为了鉴别受体细胞中是否含有目是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。出来。思考思考3：标记基因有什么作用？标记基因有什么作用？载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
25、。注意注意用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用既用到限制酶切割载体，又用到到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。的化学键都是磷酸二酯键。启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。对于目的基因表达必不可少。目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达必需以表达载体的方式携带进去。载体的方式携带进去。基因工程技术路线三、将目的基因导入受体细胞借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。（一）转化：（一）转化： 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并
26、且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（二）（二）方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞1.将目的基因导入植物细胞n农杆菌转化法农杆菌转化法n基因枪法基因枪法n花粉管通道法花粉管通道法（1 1）农杆菌转化法）农杆菌转化法特点：特点： 易感染双子叶植物和裸易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力物没有
27、感染能力原理：原理： TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细胞，可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。转化过程转化过程: :TiTi质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色染色DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌 基因枪法又称微基因枪法又称微弹轰击法，是弹轰击法，是利用压利用压缩气体产生的动力缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表将包裹在金属颗粒表面的表达载体面的表达载体DNADNA打打入受体细胞中入受体细胞中，使目，使目的基因与其整合并表的基因与其
28、整合并表达的方法。达的方法。（2 2）基因枪法）基因枪法（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，前，剪去柱头，然后，滴加滴加DNADNA（含目的基含目的基因），使目的基因借因），使目的基因借助花粉管通道进入受助花粉管通道进入受体细胞。体细胞。胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊2.将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体（将基因表达
29、载体提纯，用显微仪注射到提纯，用显微仪注射到受精卵受精卵中）中）（2 2）操作程序）操作程序: :提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物常用法常用法：CaCa2+2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：CaCa2+2+处理大处理大肠杆菌肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态感受态细胞吸细胞吸收收DNADNA3.将目的基因导入微生物
30、细胞思考：为什么要用思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？处理受体细胞？用用CaCa2 2处理，增加细菌细胞壁的通透性处理，增加细菌细胞壁的通透性受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵受精卵体细胞体细胞受精卵受精卵细胞细胞/ /个体个体农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注显微注射技术射技术用用CaCa2+2+处理成处理成感受态细胞感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）的是（）A.A.将毒素蛋白注射到受精卵中将毒素蛋白注射
31、到受精卵中B.B.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.C.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵进入受精卵D.D.将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNADNA序列，注射到棉受精卵中序列，注射到棉受精卵中四、目的基因的检测与鉴定n检测检测: :n是否插入目的基因是否插入目的基因n是否转录是否转录n是否翻译是否翻译n鉴定鉴定: :n分子水平鉴定分子水平鉴定n个体生物学水平鉴
32、定个体生物学水平鉴定1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA；（1 1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2 2）过程）过程: : 将含目的基因的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等片段用放射性同位素等作标记作标记, ,以此做以此做探针探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交, ,若显示若显示出杂交带出杂交带, ,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNADNA中。中。（一）检测（一）检测： 采用一定的技术手
33、段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 （二）鉴定（个体生物学水平）（二）鉴定（个体生物学水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分分 子子 杂杂 交交方法方法: : 抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交过程过程: :用上述探针和转基因
34、生物的用上述探针和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交, ,若出现杂交带若出现杂交带, ,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA。提取提取苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质 出现出现杂交带杂交带脱分化脱分化组织培养组织培养怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因没有抗虫基因的棉植株的棉植株有抗虫基因的有抗虫基因的棉植株棉植株棉铃虫棉铃虫虫没有死虫没有死虫被杀死虫被杀死没有表达没有表达目
35、的基目的基因表达因表达类类型型步骤步骤 检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示分分子子检检测测第一第一步步目的基因是否进目的基因是否进入受体细胞入受体细胞DNADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第二第二步步目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNAmRNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第三第三步步目的基因是否翻目的基因是否翻译出蛋白质译出蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带个个体体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、
36、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及，以确定是否有抗性以及抗性的程度；抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。否相同等。提示：提示： DNADNA分子杂交技术首先提取受体分子杂交技术首先提取受体细胞中的细胞中的DNADNA，然后高温解成单链，再，然后高温解成单链，再与同位素标记的与同位素标记的DNADNA探针杂交；探针杂交； 抗原抗体杂交所用到的抗体是抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。产生相应的抗体，并提
37、取出而来的。归纳: 基因工程的基本操作程序1. 获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRu 化学方法人工合成化学方法人工合成2. 构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3. 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u 转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）射法（动物）4. 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u 检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的为什么要构建基因文库？直接
38、从含有目的基因的生物体内提取不行吗？生物体内提取不行吗？ 构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过以通过PCRPCR方式从含有该基因的生物的方式从含有该基因的生物的DNADNA中，直接获中，直接获得，也可以通过反转录，用得，也可以通过反转录，用PCRPCR方式从方式从mRNAmRNA中获得，中获得，不一定要构建基因文库。不一定要构建基因文库。 但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，
39、或想从一种生物体内获得知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基
40、本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：寻根问底： 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理
41、理, ,你能分析出你能分析出农杆菌不能将目的基因农杆菌不能将目的基因不能导入单不能导入单子叶植物的原因吗子叶植物的原因吗? ?若将一个抗病基因导入小麦中若将一个抗病基因导入小麦中, ,理论上讲你应该怎样做理论上讲你应该怎样做? ?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使导的基因，使T-DNAT-DNA转移并插入到染
42、色体转移并插入到染色体DNADNA上。上。 酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中成，通常不存在于单子叶植物中 4.-4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，珠蛋白，想一想，应如何进行设计？想一想，应如何进行设计？（1 1）从小鼠中克隆出）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（
43、珠蛋白基因的编码序列（cDNAcDNA) )。（2 2）将）将cDNAcDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明培养基上长出大肠杆
44、菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入珠蛋白基因已进入其中。其中。（4 4）培养进入了）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取碎后从中提取-珠蛋白。珠蛋白。DNA附着在膜上附着在膜上硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜加探针加探针报告基因（含荧光素分子）报告基因（含荧光素分子）变性变性DNA分子杂交分子杂交（如检测（如检测SARS病毒等）病毒等）abcd检测是否插入目的基因，检测是否插入目的基因，利用利用DNADNA分子杂交技术分子杂交技术，目的，目的基因基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNADNA杂交，杂
45、交，看是否有杂交带。看是否有杂交带。检测是否转录出了检测是否转录出了mRNAmRNA，利用利用分子杂交技术，分子杂交技术，目的基因目的基因DNADNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNAmRNA杂交，看杂交，看是否有杂交带。是否有杂交带。检测目的基因是否翻译成蛋白质。检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。原抗体杂交，看是否有杂交带。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：提示：DNADNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNADNA，然，然后高温解成单链，再与同位素标记的后高温解成单链，再与同位素标记的DNADNA探针杂交；探针杂交； 抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较分子杂交实验分子杂交实验放放射射自自显显影影照照片片DNA链末端合成终止法链末端合成终止法