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1、2生物分离过程的一般流程生物分离过程的一般流程本章内容9细菌细胞壁结构细菌细胞壁结构u破碎细菌的主要阻力是来自于破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。在的肽键的数量和其交联的程度。u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。不同。 u革兰氏阴性革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。细胞生产了很多细胞重组的产物。药物名称药物名称宿主宿主用途用途
2、胰岛素胰岛素大肠杆菌大肠杆菌治疗糖尿病治疗糖尿病人生长激素人生长激素大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病-干扰素干扰素大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等治疗毛状细胞白血病等10 酵母细胞壁的结构示意图酵母细胞壁的结构示意图u最里层是由葡聚糖的细纤维最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的性骨架，使细胞具有一定的形状，形状，u上面的是一层糖蛋白，上面的是一层糖蛋白，u最外层是甘露聚糖，由最外层是甘露聚糖，由1,61,6- -磷酸二酯键连接成网状。在磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖该层的内部，有甘露聚糖- -酶的复合物。酶的复
3、合物。u破碎酵母细胞壁的阻力主要破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。度和它的厚度。11真菌的细胞壁真菌的细胞壁l真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。还含有较少量的蛋白质和脂类。l不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。糖构成，少数含纤维素。l与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不
4、仅如此，强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。以强度有所提高。12l红面包霉菌细胞壁具有同心圆层红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物状结构主要存在三种聚合物l最外层最外层(a)(a)是是-和和-葡聚糖的葡聚糖的混合物，混合物，l第第2 2层层(b)(b)是糖蛋白的网状结构是糖蛋白的网状结构l第第3 3层层(c)(c)主要是蛋白质，主要是蛋白质，l最内层最内层(d)(d)主要是几丁质。主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图红面包霉菌细胞壁的结构示意图13微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌
5、阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%
6、)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋
7、白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成和结构细胞壁的组成和结构14植物细胞壁的结构植物细胞壁的结构l对于已生长结束的植物细胞壁可分为对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生初生壁和次生壁两部分。壁两部分。l初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1 13m3m），富有弹性。
8、），富有弹性。l由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-D-葡聚糖，许葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。多这样的长链形成微纤丝。l它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。自于微纤丝。15植物次生细胞壁植物次生细胞壁 某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4m(4m以上以上) )，常有三层组成
9、。，常有三层组成。n在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。而且存在木质素的沉积。 因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。使植物细胞具有很高的机械强度。16研研 磨磨15.2 15.2 细胞破碎技术细胞破碎技术17机械破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机
10、械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理18一机械法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（homogeniz
11、ationhomogenization）高速珠研磨破碎法（高速珠研磨破碎法（bead grindingbead grinding）超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicationultrasonication）19采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。1.高压匀浆法高压匀浆法（High-pressure homogenization）细胞悬浮液自高压室针细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向击环上，被迫改变方向从出口管流出
12、。细胞在从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、碰中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细撞及压力骤降，造成细胞破碎。胞破碎。2021高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多高压匀浆器的种类较多：pWABWAB公司的公司的AVP Gaulin 31MRAVP Gaulin 31MR型型pBran and luebbe Bran and luebbe 公司公司SHL40SHL40型型p意大利意大利Niro SoaviNiro Soavi高压匀浆机高压匀浆机22高压匀浆法使用时注意事项高压匀浆法使用时注意事项u高压匀浆器的操作温度上升约高压匀浆器的
13、操作温度上升约- -/10MPa/10MPa为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在温度，使出口温度调节在2020左右。左右。u可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式。式。u在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。多次循环的操作方法。23高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围大规模细胞破碎的常用方法大规模细胞破碎的常用方法高压匀浆法适用的范围：高压匀
14、浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，料液细胞浓度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高压匀浆法。不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）浆阀）24影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细胞分率符合如下公式：被破碎的细胞分率符合如下公式： ln1/(1-R)=KNPln1/(1-R)=KNP (15-1) (15-1) 式中式中 R R 破
15、碎率，为破碎率，为NN次循环后，蛋白次循环后，蛋白质的释放量质的释放量RnRn与最大释放量与最大释放量RmRm之比；之比； K K 与温度有关的速度常数；与温度有关的速度常数； P P 操作压力，操作压力，MPaMPa； 与微生物种类有关的常数。与微生物种类有关的常数。25l升高压力有利于破碎，升高压力有利于破碎，减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。但但p p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p
16、 p超生一定值时，超生一定值时，R R增加但很慢。增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为在工业生产中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。l破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素影响高压匀浆器细胞破碎因素26高压匀浆法高压匀浆法-X-X-挤压器挤压器l改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至改进的高压方法：将浓缩的菌体
17、悬液冷却至- -2525至至-30-30形成冰晶体，利用形成冰晶体，利用500MPa500MPa以上的以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。l细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋在冰中的细胞变形所引起的。在冰中的细胞变形所引起的。l主要用于实验室中。主要用于实验室中。l优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高粉碎程度低以及活性的保留率高l对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。272）珠磨法 bead millu
18、珠磨是常用的方法u细胞悬浮液与极细的玻璃小细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于剂（直径小于1mm1mm）一起快速）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内撞，使细胞破碎，释放出内含物。含物。u在工业规模的破碎中，常采在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机用高速珠磨机WSK卧式高效全能珠磨机28高速珠磨机工作原理l磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；高速旋转，使细胞悬浮液
19、和玻离小珠相互搅动；l细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起l在出口处，旋转园盘和出口平在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。离小珠，使不被料液带出。l由于操作过程中会产生热量，由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，以冷故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。却细胞悬浮液和玻离小珠。29Netzsch LM-20型珠磨机A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘C-环形震动侠缝分离器D-变速马达1和2料液进出口3和4 搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷
20、却剂进出口l园盘以两种位置交错地安装在轴上，l一种处于径向，一种与轴倾斜，l径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。l由于交错的运动，提高了破碎效率。30珠磨机破碎作用方程u破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：符合下列公式： ln1/(1-R)=Kt 15-2ln1/(1-R)=Kt 15-2 uR R 破碎率；破碎率；K K一一 一级反应速度常数；一级反应速度常数；t t一一 时间。时间。uK K与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。装量和珠体
21、直径，以及温度等相关。珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%80%以下：降低能耗、减少大分以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。易分离而给后续操作带来的困难。313）超声波破碎l超声波破碎法（超声波破碎法（Ultrasonication)Ultrasonication)利用超声波利用超声波振荡器发射的振荡器发射的15-25kHz15-25kHz的超声波探头处理细胞的超声波探头处理细胞悬浮液。悬浮液。l超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介超声波振荡器以可分为
22、槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。l超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。声波的声频、声能有关。32超声波破碎的机理JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机(一般认为在超声波作用下液体发生空化作用一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（cavitation),cavitation),(液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上造成了剪切力，使
23、细胞内液体发生流动，从上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。而使细胞破碎。(操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。外部冷却的容器中进行。33超声波破碎的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，G-G-细菌比细菌比G+G+细菌易破细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。活性物质失活。超声波破
24、碎的有效能量利用率极低超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但但。34技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例匀浆法匀浆法(孔型孔型)须使细胞通过的小须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液大规模细胞悬浮液大规模处理处理珠磨破碎珠磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞的大规模处理超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液小规
25、模细胞悬浮液小规模处理处理研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中 便宜便宜匀浆法匀浆法(片型片型)细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎适中适中 适中适中动物组织及动物细动物组织及动物细胞胞不同机械破碎方法的比较35非机械破碎方法非机械破碎方法酶溶破碎法（酶溶破碎法（enzyme lysisenzyme lysis）化学破碎法（化学破碎法（chemical treatmentchemical treatment）去垢剂破碎法（去垢剂破碎法（detergentsdetergents）渗透压冲击破碎法（渗透压冲击破碎法（osmotic shockosmotic shock）冻融破碎法（冻融
26、破碎法（freezing and thawingfreezing and thawing）36二二 非机械法非机械法非机械方法很多1 酶解2 化学法溶胞3 物理法n渗透压冲击n冻结和融化n干燥法其中酶法和化学法溶胞应用最广。二37 1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶等壳多糖酶等38外加酶法n酶解法的特
27、点是专一性强，因此在选择酶系统时，必酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。须根据细胞的结构和化学组成来选择。l溶菌酶（溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的子的-1,4-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂效果，必须与螯合剂EDTAEDTA一起
28、使用。一起使用。l放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，为主要成分，所以也能采用溶菌酶，l酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。l植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。半纤维素酶裂解。39外加酶法有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。
29、入时需确定相应的次序。 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质用蛋白质- -甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。裂，释出胞内产物。40酶解法的特点 优点：u发生酶解的条件温和u能选择性地释放产物u胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整缺点：缺点：溶酶价格高，溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶溶酶法通用性差（不同菌种需选择不
30、同的酶) )产物抑制的存在。产物抑制的存在。 41酶解-自溶作用 l 自溶作用是酶解的另一种方法，自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。下去。l自溶作用：改变其生长环境（温度、缓自溶作用：改变其生长环境（温度、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。生其它的自溶酶，以达
31、到自溶目的。l缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细缺点是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。42某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。2 化学渗透法化学渗透法（Chemical permeation）该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组
32、成。 43n酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。n碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。成本低，反应激烈，不具选择性。成本低，反应激烈，不具选择性。（1）酸、碱处理法）酸、碱处理法44细胞破碎常用的表面活性剂：细胞破碎常用的表面活性剂：十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；。，阴离子型）；。非离子型如非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温（和吐温（TweenTween）等）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内
33、物质释放出来。内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。（2 2）表面活性剂）表面活性剂无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解透性增加或溶解45能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 （3 3）有机溶剂）
34、有机溶剂（4 4）EDTAEDTA螯合剂螯合剂处理处理G-G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-G-细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子CaCa2+2+或或MgMg2+2+结合脂多糖结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦和蛋白质来维持，一旦EDTAEDTA将将CaCa2+2+或或MgMg2+2+螯合，大量的脂多糖螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。46u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%50%；u有些化学试剂有毒。有些
35、化学试剂有毒。u化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度并影响最终产物纯度化学渗透法特点：化学渗透法特点：缺点缺点l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；大分子量的物质仍滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。分离和进一步提取。优点优点473 3 物理法物理法u渗透压冲击法渗透压冲击法u冻结冻
36、结-融化法融化法u干燥法干燥法481）渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，n将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先
37、用酶处理仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。细胞壁有缺陷，强度减弱。49 2）冻结-融化法 将细胞放在低温下冷冻（约将细胞放在低温下冷冻（约-15-15），然后在室温中），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。融化，反复多次而达到破壁作用。 一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，的亲水性能， 另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。破裂。 适用
38、于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 50使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。提出来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质
39、冷冻干燥适用于不稳定的生化物质3 3）干燥法）干燥法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥5152选择破碎方法的依据：选择破碎方法的依据：u细胞处理量；细胞处理量； u细胞壁强度和结构细胞壁强度和结构( (高聚物交联程度、种高聚物交联程度、种类和壁厚度类和壁厚度) )；u目标产物对破碎条件的敏感性；目标产物对破碎条件的敏感性； u破碎程度；破碎程度；u目标产物的选择性释放目标产物的选择性释放53选择性释放目标产物的一般原则仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围l当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法、渗透压冲
40、击法和冻结融化法等。方法，如酶溶法、渗透压冲击法和冻结融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法械破碎法l当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液调节溶液PHPH值，离子强度或添加与目标产物具有亲值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。物容易溶解释放。(2)机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。54 讨论题：青霉素酰化酶细胞
41、破碎的研究讨论题：青霉素酰化酶细胞破碎的研究 一一. 化学法化学法 20%(W/V)大肠杆菌悬浮液大肠杆菌悬浮液 + B.A 37搅拌搅拌 高高速离心速离心 测上清液酶活。测上清液酶活。1.处理时间处理时间 R% 2.5h2. 丁酯用量丁酯用量条件：条件：37 ，搅拌，搅拌3小时小时适宜的适宜的B.A加量为加量为12% ，释放率释放率R=55%12%55%R12%2.03U/mg比活55二二. 化学法化学法冻融法结合冻融法结合 加加B.A(12%,37B.A(12%,37搅拌搅拌3h3h） 菌悬液菌悬液 冻融冻融( (冻结冻结14h 14h 融化融化) ) 释放率释放率70%70%；比活；比活
42、2.69 u/mg2.69 u/mg 三三. 化学化学超声波振荡法结合超声波振荡法结合 先丁酯处理，再超声波（先丁酯处理，再超声波（9090秒），秒），释放率释放率72%72% 小型设备，不能工业大规模生产。小型设备，不能工业大规模生产。四四. 高压匀浆法高压匀浆法 20%(W/V)20%(W/V)菌悬液，菌悬液，P=50MPaP=50MPa，N=3N=3。释放率释放率R=38.4%R=38.4%， 原因原因: :细胞破碎后细胞破碎后, ,仍有较多酶吸附在细胞碎片上。仍有较多酶吸附在细胞碎片上。五五. 高压匀浆高压匀浆化学法结合化学法结合 先高压匀浆，再加先高压匀浆，再加10%10%丁酯，丁酯
43、，3737搅拌搅拌3h3h，高速离心，高速离心(3(3万万rpm)rpm)，释放率释放率：R=60%R=60%六六. 珠磨珠磨 直径直径0.4mm0.4mm玻璃珠。玻璃珠。释放率释放率：R=95%R=95%56破碎率的测定破碎率的测定细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。使导电率上升。 直接测定法直接测定法 目的产物测定法目的产物测定法 导电率测定法导电率测定法采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴
44、性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。色，而受损害的细胞呈亮红色。将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与或活性，并与100%100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。破碎率的标准值比较，计算其破碎率。57破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向 多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、渗透压法结合如
45、用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa95MPa压压力下匀浆力下匀浆4 4次，总破碎率接近次，总破碎率接近100%100%。而单独采用高压匀。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有浆法，同样条件下破碎率只有32%32%。有机溶剂与冻融法、干燥法结合有机溶剂与冻融法、干燥法结合58破碎技术的研究方向破碎技术的研究方向- -与上游过程相结合与上游过程相结合v在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pHpH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因
46、素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。膜的结构与组成有一定的影响。v在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂制剂( (如青霉素如青霉素) )，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其，继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；细胞壁有缺陷，利于破碎；v选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；v用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌用基因工程的方法对菌种进行改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活体基因，培养结束后，
47、控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。59破碎技术研究方向破碎技术研究方向-与下游工程相结合与下游工程相结合举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶60（ inclusion bodies IBs)15.4 15.4 基因工程包含体的纯化基因工程包含体的纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程菌培养液不同表达形式的前处理(胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心, ,收集液相收集液相浓缩浓缩纯化。纯化。(胞内表达：胞内表达：l胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心, ,收集菌体
48、收集菌体细胞破碎细胞破碎离心，离心，收集上清收集上清纯化纯化l胞内周质表达：离心胞内周质表达：离心, ,收集菌体收集菌体低浓度溶菌酶或渗透低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物压冲击等溶解目标物离心离心, ,收集上清液收集上清液纯化。纯化。l不溶性包涵体：离心不溶性包涵体：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心离心, ,收集收集沉淀沉淀包涵体洗涤包涵体洗涤目标蛋白变性溶解目标蛋白变性溶解复性复性纯化。纯化。61外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白蛋白产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体 - -丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在
49、细胞间区在细胞间区-人体干扰素人体干扰素25%25%形成包涵体形成包涵体凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体牛生长激素牛生长激素30%30%形成包涵体形成包涵体 - -内酰胺酶内酰胺酶形成间区包涵体形成间区包涵体人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包涵体形成包涵体62Z 包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。物活性。Z 包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常包涵体的形成：大
50、肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。Z 高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？ 蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；表达蛋白过多，与其结合表达蛋白过多，与其结合/ /诱导组分不足，不能形成溶解状态诱导组分不