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1、NO.: VSF-02-037 消毒剂消毒效果验证文件编制：日期： 2011年月日审核：日期： 2011年月日批准：日期： 2011年月日XXX 生物科技有限公司公司质量管理体系文件名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 21 页 - - - - - - - - - I目录1. 验证方案制定及审批 . 2 2. 概述 . 2 3. 验证目的 . 3 4. 验证内容 . 3 5. 验证实施步骤 . 3 6. 验证主要依据 . 11 7. 验证合格标准 . 11 8.
2、 再验证周期 . 11 9. 附件 . 11 10. 验证报告 . 19 11. 验证证书 . 20 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 21 页 - - - - - - - - - VSF-02-037 2 消毒剂消毒效果验证文件1. 验证方案制定及审批验证项目消毒剂消毒效果验证文件验 证 小 组成员职务姓名部门主 要 职 责组长质量部项目负责人成员质量部方案实施责任人生产部方案实施人质量部检验员验证方案组织实施进度方案制定时间年月日方案实施时间年月日方案报
3、告时间年月日起草人（签名）：起草日期：审查人（签名）：审查日期：批准人（签名）：批准日期：2. 概述洁净区用消毒剂对地漏、地面、墙面、操作台、设备表面及非灭菌容器具表面等进行消毒，旨在控制微生物污染水平，防止微生物在生产环境中污染及交叉污染，保证生产环境符合工艺卫生要求， 最终保证产品质量。 本公司车间洁净区分为十万级、万级，所使用的消毒剂种类及使用对象如下图：消毒剂名称所使用对象75% 乙 醇移液器、设备表面、不锈钢操作台、手部0.2%新洁尔溶液地漏、地面、墙面、操作台、设备外表面、手部0.1%醋酸洗必泰溶液地漏、地面、墙面、操作台、设备外表面、手部0.5%醋酸洗必泰溶液地漏、地面、墙面、操
4、作台、设备外表面、手部名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 21 页 - - - - - - - - - VSF-02-037 3 我公司产品为分子诊断试剂，活菌数数量较大，为防止交叉污染，确认用此消毒剂消毒后生产环境内物体表面不残留控制菌和目的菌，保证我们使用的消毒剂能够对目的菌起到强抑制作用，能达到预期的消毒效果，必须对消毒剂的消毒效果进行验证。本方案结合生物指示剂挑战性试验（特定菌挑战试验）和现场考察试验，对消毒剂的杀菌效力进行确认。3. 验证目的确认洁净
5、区按照规定的清洁、消毒程序进行清洁消毒后，能够达到防止交叉污染的目的，并在消毒有效期内能确保达到生产工艺所需要的效果。4. 验证内容本验证先在实验室对所使用的消毒剂，用 4 种菌做中和剂鉴定试验， 定量悬浮试验 ；然后做现场消毒考察实验，即现场消毒后用棉签取样法对消毒后的表面取样，做表面残留微生物限度检查。 通过对 指示菌 的杀灭对数值和现场消毒后洁净区表面微生物的残留限度来确认消毒剂的消毒效果。5. 验证实施步骤5.1 验证前准备：在进行消毒剂消毒效果验证前，洁净厂房空气净化系统应经验证合格并正常运行，设备动力部应提供洁净厂房空气净化系统的验证报告 、空气净化系统操作程序 ；与验证相关的各种
6、设备、仪器均需通过相应验证，所需仪表、计量器具均需校验合格并具备校验证书 。5.2 验证所需文件资料：验证所需文件资料资料名称编号活菌数检测操作规程菌落计数操作规程培养基配制操作规程SOP-08-404 培养基配制、使用管理规程SMP-08-011 消毒剂配制操作规程消毒剂的使用操作规程实验器具清洗操作规程实验器具灭菌、消毒及使用操作规程名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 21 页 - - - - - - - - - VSF-02-037 4 进出微生物限度实
7、验室操作规程QL-901型振荡器操作规程BSA124S 电子天平操作规程DHP400 型电热恒温箱操作规程DHP400 型电热恒温箱清洁规程微生物实验室管理规程SMP-07-307 PB-10 计操作规程SOP-02-011检定菌管理规程SMP-08-011 洁净区清场操作规程设备清洁操作规程5.3 器材与试剂5.3.1 菌株（1）细菌：金黄色葡萄球菌大肠杆菌（2）细菌芽孢：枯草杆菌芽孢（3）真菌：白色念珠菌5.3.2 培养基：营养琼脂培养基5.3.3 稀释液： 0.9%无菌氯化钠溶液（ NS ）5.3.4 中和剂： 1% 卵磷脂 +0.1%聚山梨酯 80 5.3.5 无菌载片： 12mm 直
8、径圆形不锈钢片5.3.6 无菌试管5.3.7 无菌平皿 (90mm) 5.3.8 含玻璃珠的无菌三角瓶5.3.9 消毒剂： 75% 酒精， 0.2%新洁尔灭， 0.1%醋酸洗必泰， 0.5%醋酸洗必泰5.3.10 移液器及配套无菌吸头 :0-100ul ，100-1000ul 5.3.11 计时器5.3.12 超净工作台5.3.13 电动混合器5.3.14 恒温培养箱5.3.15 人工菌落计数器5.4 中和剂鉴定试验名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 21 页
9、 - - - - - - - - - VSF-02-037 5 5.4.1 试验目的通过该试验，确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用，对试验用菌剂及其恢复期培养示范有害或不良影响5.4.2 菌液的制备及计数接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌、白色念珠菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中， 3035培养 1824 小时。取上述培养物用 0.9 无菌氯化钠溶液做 10 倍系列稀释成 1108- 5108CFU/ml的工作菌液。计数时，将 1108- 5108CFU/ml的工作菌液 10 倍系列稀释成含50100CFU/ml菌液，并同时采用营养琼脂培养基3035培养 2 天计数。计
10、算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数。5.4.3 鉴定试验操作5.4.3.1配制 75% 乙醇、 0.2%新洁尔灭溶液、 0.1%醋酸洗必泰、 0.5%醋酸洗必泰。将配置好的消毒剂置 201恒温水浴锅中备用。5.4.3.2分组操作试验分组及稀释操作方法简表具体操作第 1 组目的：观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。操作：组号混合液 A 混 匀 作用10min 混合液 B 混 匀 作用10min 取混合液 B 或混合液 B 的稀释级溶液0.5ml 平板计数（ 2皿/ 组）取 0.5ml 工作菌液加入下列溶液中取 混 合 液A 0.5ml 加入下列溶液1 消毒剂 4.5m
11、l 稀释液 4.5ml 混合液 B、10-12 消毒剂 4.5ml 中和剂 4.5ml 混合液 B、10-13 中和剂 4.5ml 稀释液 4.5ml 10-2、10-34 中和产物4.5ml（消毒液与中和剂比例为 1:1 ）稀释液 4.5ml 10-2、0-35 稀释液 4.5ml 稀释液 4.5ml 10-2、10-36 稀释液和中和剂各1.0ml 注入无菌平皿中，各制备2 皿。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 21 页 - - - - - - - -
12、- VSF-02-037 6 取消毒剂 4.5ml+工作菌液 0.5ml ，混匀作用 10min 后，取混合液 0.5ml+ 稀释液 4.5ml ，混匀作用 10min，取 0.5ml 注皿，平行制备 2 皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基， 倒置 3035培养 3 天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置 2328培养 5 天计数计数。第 2 组目的：观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。操作：取消毒剂 4.5ml+工作菌液 0.5ml ，混匀作用 10min 后，取混合液 0.5ml +中和剂 4.5ml ，混匀作用 10min， 用稀释液
13、稀释成 10-1。 分别取未稀释溶液（混合液 0.5mll+ 中和剂 4.5ml的混合液）及10-1 0.5ml注皿，各平行制备2 皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于 3035培养 3 天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置于2328培养 5 天计数。第 3 组目的：观察中和剂是否有抑菌性操作：取中和剂 4.5ml+工作菌液 0.5ml ，混匀作用 10min，取混合液 0.5ml l+ 稀释液 4.5ml ，混匀作用 10min 后，用稀释液进行10 倍系列稀释成 10-2、10-3。取相应稀释级 0.5ml注皿，各稀释级平行制备2 皿。金黄色葡萄球菌、
14、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养 3 天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养 3 天计数计数。第 4 组目的：观察中和产物，或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。操作：取消毒剂和中和剂 1:1 的混合液 4.5ml+工作菌液 0.5ml ， 混匀作用 10min， 取混合液 0.5ml +稀释液 4.5ml ，混匀作用 10min 后，用稀释液进行 10 倍系列稀释成 10-2、10-3。取相应稀释级 0.5ml 注皿，各稀释级平行制备2 皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基， 倒置 3035培养 3 天计数；
15、白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置 3035培养 3 天计。第 5 组目的：作菌落数对照用名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 21 页 - - - - - - - - - VSF-02-037 7 操作：取稀释液 4.5ml+工作菌液 0.5ml ，混匀作用 10min，取混合液 0.5ml +稀释液 4.5ml ，混匀作用 10min 后，用稀释液进行 10倍系列稀释成 10-2、10-3。取相应稀释级 0.5ml 注皿，各稀释级平行制备2 皿。金黄色葡萄球菌
16、、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置 3035培养 3 天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基，倒置3035培养 3 天计数。第 6 组目的：作为阴性对照用操作：分别取稀释液和中和剂各1.0ml 注入无菌平皿中，各制备2 皿。结果判断试验结果应符合下列全部条件，判断所选中和剂合格。第 1 组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。第 2 组菌落数比第 1 组菌落数多，但比第3、4、5 组菌落数少，且符合下表要求第 3、4、5 组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过15% 。计算公式如下：（3 组间菌落平均数 - 各组菌落平均数）的绝对值之和误差率10033 组间菌落平均数第 6
17、组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。5.4.3.3 结果记录附件 1 ：中和剂鉴定试验结果记录5.5 定量悬浮试验5.5.1 试验目的由于 0.2%的新洁尔灭溶液、 0.1%醋酸洗必泰溶液、 0.5%醋酸洗必泰溶液是通过浸泡或液封消毒，通过定量悬浮试验，确定其消毒效力是否符合要求。第 1 组平板平均菌落数第 2 组平板平均菌落数0 5 x (x+5) y (y+0.5y) 名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 21 页 - - - - - - -
18、- - VSF-02-037 8 5.5.2 试验操作5.5.2.1 配制 0.2%的新洁尔灭溶液、 0.1%醋酸洗必泰溶液、 0.5%醋酸洗必泰溶液， 操作执行清洁剂和消毒剂管理。将配置好的消毒剂置201恒温水浴锅中备用。5.5.2.2 由于 0.2%的新洁尔灭溶液中低效消毒剂， 且不能杀灭芽孢， 故定量悬浮试验用菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌。0.1%醋酸洗必泰、 0.5%醋酸洗必泰溶液为高效消毒剂，能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌枯金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌。5.5.2.3 将菌液制备成 11085108CFU/ml的工作菌液，菌液的制备及计数同上。5
19、.5.2.4 将试管按需要分组排列在试管架上， 试验组分 3 组 （4min、 5min、 6min 各一组），并由左向右逐管标明消毒剂、中和剂、10-1、10-2。对照组分 1 组，并由左向右逐管标明稀释液、中和剂、 10-1、10-2 、10-3、10-4 。5.5.2.5 向个试管加入 4.5ml 相应的试剂，标明10-1、10-2、10-3、10-4 。加入 4.5ml 的稀释液。5.5.2.6 吸取工作菌液 0.5ml 加入标明消毒剂的试管中， 对照组加入标明稀释液的试管中，迅速混匀，并开始计时。5.5.2.7 待菌液与消毒剂相互作用至8min、10min、12min，吸取菌液和消毒
20、剂混合液0.5ml ，加入标明中和剂的试管中，迅速混匀。5.5.2.8 中和作用 10min 后，吸取 0.5ml 加入标明 10-1的试管中，混匀后吸取0.5ml 加入标明 10-2试管中（对照组以此类推，对照组直至10-4） 。5.5.2.9 试验组分别取中和剂管、 10-1、10-2管溶液 1ml 按平皿法测定存活菌数； 对照组取 10-3、10-41ml 按平皿法测定存活菌数。每管平行制备2 皿。5.5.2.10 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于3035培养 3 天计数；白色念珠菌用营养琼脂培养基， 倒置于 2328培养 5 天计数计数。5.5.3 结
21、果计算计算试验组和对照组的活菌浓度（CFU/ml） ，并换算为对数值（ N） ，并按下式计算杀灭对数值 : 杀灭对数值(KL) 对照组平均活菌浓度的对数值 （NO ）试验组活菌浓度对数值 （NX ）5.5.4 可接受标准杀灭对数值(KL) 应不低于 35个对数单位。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 21 页 - - - - - - - - - VSF-02-037 9 附件 2 ：定量悬浮试验结果记录5.6 现场考察试验5.6.1消 毒剂 的配 制： 洁净
22、区操 作人 员按 照 消毒 剂的 配制 和 使 用 操 作 过 程 （SOP ）配制 75 %酒精、 0.2%新洁尔灭、 0.1%醋酸洗必泰， 0.5%醋酸洗必泰5.6.2 生产结束后操作人员按照生产车间区清洁 SOP 对洁净区进行清洁消毒。5.6.3 清洁消毒完毕 15 分钟后，现场QA 使用棉签取样法对清洁消毒后的洁净区进行表面微生物监测取样，共测定 3 次。5.6.4 取样点的确定：各洁净区十万级抽取二个操作间；万级抽取两个操作间。选择操作间的墙面、地面、设备外壁以及操作台最难清洁的地方作为取样点。附件 3 表面微生物监测位点。5.6.5 取样面积： 25cm25.6.6 取样方法：棉签
23、取样法5.6.7 取样程序：a 样人员用经过灭菌处理的生理盐水润湿经过灭菌处理的棉签，并将其靠在溶剂瓶上挤压，以除去多余的溶剂；b 棉签按在取样表面上，用力使其稍弯曲，按图 A，平稳而缓慢地擦拭取样表面。在向前移动的同时将其从一边移到另一边。擦拭过程应覆盖整个表面。翻转棉签，按图B，让棉签的另一面也进行擦拭。但与前次擦拭移动方向垂直，见下图：图 A 图 B c. 擦拭完毕后，将棉签放入试管中， 并加盖密封。d. 向试管中加入 10ml 灭菌后的生理盐水，振摇10分钟。e. 空白样品的制备： 按 以上第二步湿润棉签，将棉签直接放入试管并加盖密封。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - -
24、- - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 21 页 - - - - - - - - - VSF-02-037 10 f. 取样完成后，在试管上注明有关取样信息、编号，并做好取样记录。g. 所有样品送质检室进行检测。5.6.8 检测方法：将取样后的纱布或脱脂棉放入广口瓶中，加一定量的浸出液 （10ml 灭菌生理盐水）充分振摇10 分钟，按微生物检查法进行检测。同时做空白对照试验。5.6.9 测定结果记录附件 4 ：洁净区表面微生物监测结果记录5.6.10 合格标准洁净级别表面菌落数（非地面）表面菌落数 （地面）10
25、0 级1cfu/ 皿3 cfu/ 皿10000 级5 cfu/ 皿10 cfu/ 皿100000 级15 cfu/ 皿30 cfu/ 皿名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 21 页 - - - - - - - - - 11 6. 验证主要依据6.1 药品生产验证指南6.2 消毒技术规范（2008 年版）6.3 中国药典（2010 年版）7. 验证合格标准7.1 生物指示剂挑战性实验判定合格标准：消毒剂对挑战菌的杀灭对数值3 判为合格。7.2 现场考察试验合格
26、标准洁净级别表面菌落数（非地面）表面菌落数 （地面）100 级1cfu/ 皿3 cfu/ 皿10000 级5 cfu/ 皿10 cfu/ 皿100000 级15 cfu/ 皿30 cfu/ 皿8. 再验证周期8.1 当消毒剂的使用浓度和清洁消毒程序发生变更时应进行再验证。8.2 当环境中出现新类型的微生物时，应以该微生物为挑战菌进行再验证。8.3 当有新的消毒剂被使用时应进行验证。9. 附件名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 21 页 - - - - - -
27、 - - - 12 附 件 1 中和剂鉴定试验结果记录检测人：复核人：年月日年月日消毒剂菌株各组回收菌落平均数3、4、5 组平均数3、4、5 组误差率75% 乙醇大肠杆菌1 2 3 4 5 6 金 黄 色 葡萄球菌白 色 念 珠菌枯 草 芽 孢杆菌0.1%新洁尔灭大肠杆菌金 黄 色 葡萄球菌白 色 念 珠菌枯 草 芽 孢杆菌0.1%醋酸洗必泰大肠杆菌金 黄 色 葡萄球菌白 色 念 珠菌枯 草 芽 孢杆菌0.5%醋酸洗必泰大肠杆菌金 黄 色 葡萄球菌白 色 念 珠菌枯 草 芽 孢杆菌名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - -
28、名师精心整理 - - - - - - - 第 13 页，共 21 页 - - - - - - - - - 13 附件 2-1 定量悬浮试验结果记录检测人：复核人：年月日年月日消毒剂菌株灭 菌 时 间（min）稀释倍数结果计数杀灭对 数值（KL）备注10-1 （对照组 10-3）10-2 （对照组 10-3）75% 乙醇大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌枯草芽孢杆菌名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 14 页，共 21 页 - - - - - - - - - 14 附件 2-
29、2 ：定量悬浮试验结果记录检测人：复核人：年月日年月日消毒剂菌株灭 菌 时 间（min）稀释倍数结 果 计数杀 灭 对 数值（KL）备注10-1 （对照组 10-3）10-2 （对照组 10-3）0.2%新洁尔 灭 溶液大 肠 杆菌金 黄 色葡 萄 球菌白 色 念珠菌枯 草 芽孢杆菌名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 15 页，共 21 页 - - - - - - - - - 15 附件 2-3 ：定量悬浮试验结果记录检测人：复核人：年月日年月日消毒剂菌株灭 菌 时 间（
30、min）稀释倍数结果计数杀灭对数值（KL）备注10-1 （对照组 10-3）10-2 （对照组 10-3）0.1% 醋酸洗 必 泰溶液大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌枯草芽孢杆菌名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 16 页，共 21 页 - - - - - - - - - 16 附件 2-4 ：定量悬浮试验结果记录检测人：复核人：年月日年月日消毒剂菌株灭 菌 时 间（min）稀释倍数结果计数杀灭对数值（KL）备注10-1 （对照组 10-3）10-2 （对照组 10-3）
31、0.5% 醋酸洗 必 泰溶液大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌枯草芽孢杆菌名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 17 页，共 21 页 - - - - - - - - - 17 附件 3 表面微生物监测位点操作间取样点洁净级别十万级配制一室操作台十万级设备外表面十万级墙面十万级十万级包被一室操作台十万级设备外表面十万级墙面十万级万级配制一室操作台万级设备外表面万级墙面万级万级分装一室操作台万级设备外表面万级墙面万级万级质检微生物检验室操作台万级设备外表面万级墙面万级名师资料总
32、结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 18 页，共 21 页 - - - - - - - - - 18 附件 4 洁净区表面微生物监测结果记录年月日操作间取样点洁净级别平均菌数第一次第二次第三次十万级配制一室操作台十万级设备外表面十万级墙面十万级十万级包被一室操作台十万级设备外表面十万级墙面十万级万级配制一室操作台万级设备外表面万级墙面万级万级分装一室操作台万级设备外表面万级墙面万级万级质检微生物检验室操作台万级设备外表面万级墙面万级检测人：复核人：年月日年月日名师资料总结 - -
33、-精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 19 页，共 21 页 - - - - - - - - - 19 10.验证报告验证 报 告验证实施概要验证结果小结结论名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 20 页，共 21 页 - - - - - - - - - 20 11.验证证书验证证书经审核，验证方案合理，验证结果符合规定，特此发给验证证书，批准“”投入使用。批准人：日期：名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 21 页，共 21 页 - - - - - - - - -