《2022年ProteinA亲和层析柱亲和层析纯化人IgG类嵌合抗体 .pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年ProteinA亲和层析柱亲和层析纯化人IgG类嵌合抗体 .pdf（3页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、技术方法名称 : Protein A sepharose 4 fast flow亲和层析柱纯化人IgG1 类嵌合抗体基本原理：葡萄球菌 A 蛋白（staphylococcal protein A）在 pH 值中性或碱性条件下与多种哺乳类动物 IgG 分子的 Fc 段特异结合，而在酸性条件下可以解离，可用于纯化人和小鼠 IgG 及其亚类（ IgG3 除外） 。sepharose 4 fast flow是高度交联的4% 的 agarose 衍生物， 具有很好的动力学，在固相亲合吸附中有很好的层析质量，其刚性使其可理想地用于生产规模。 Protein A sepharose 4 fast flow
2、是 protein A 与 固相基质 sepharose 4 fast flow的结合，是高特异、高稳定性凝胶，当凝胶装填柱床后，能够特异性捕获目的抗体。用途及受限因素：1、Protein A sepharose 4 fast flow的 IgG 高载量和允许样品通过的高流速，使其成为实验室和生产规模制备抗体的理想凝胶。2、Protein A sepharose 4 fast flow在纯化过程中会有少量集团脱落，如需去除用离子交换 Q Sepharose HP 或凝胶过滤 superdex 200 。3、在不同 IgG 亚类之内，甚至在相同亚类之内，都存在着天然的多样性，因此对于每个待纯化的
3、单抗都必须首先优化选择结合和洗脱系统。4、层析几批样品之后，尤其流速明显减慢之后，需重装柱子。实验材料：1.1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱生产厂商： pharmacia 公司2.有抗体分泌的细胞上清（本实验室构建的嵌合抗体为人IgG1 类嵌合抗体，宿主细胞CHO）3.柱体平衡液： 0.1M PB 缓冲液 （PH7.0）4.抗体洗脱液： 0.1mol/L 柠檬酸 柠檬酸钠缓冲液（ PH3.0）5.1mol/L Tris 碱溶液（不调 PH）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - -
4、 - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - 6.透析液： 0.01M PBS （ PH7.4）7.20%乙醇8.0.45m 滤器9.真空泵（本操作流程操作程序以1ml 凝胶为例）实验设计：1样品处理： 取一定体积的有抗体分泌的细胞培养上清。（根据 1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow亲和层析柱能有效结合约14mg的抗体，结合待纯化上清中抗体含量，计算出最大纯化上清的体积） 将细胞上清 4离心 10000rpm 20min，去除细胞碎片。 细胞上清经 0.45m滤膜抽滤脱气， 除去未沉降的蛋白等一些
5、杂质， 留样 1ml，记录样品体积。 用 10mM 的 NaOH 调节上清的 pH 值至 7.0 左右。2平衡柱子：以 0.1M 的 PB （PH7.0）缓冲液平衡 1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow 亲和层析柱，流速 1ml/min，体积 20ml ，充分去除乙醇和杂质，平衡至OD28050ml ，洗涤至 OD2800.01，保留液体待测。5洗脱：以 0.1M 的柠檬酸（ PH3.0）缓冲液洗脱上样后的1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow 亲和层析柱，流速1ml/min,体积不限，分管收集，同时用1M Tris 调其 PH
6、至 7.0 左右，洗脱至 OD2800.01 ，保留液体待测。6纯化后抗体处理：名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 用分光光度计测 OD280，初步计算产量。 将该样品置于透析袋中，在PBS（PH7.4）中透析，换液 23 次，6-8h/次。 将样品用无菌的 0.2 M 的滤器过滤纯化的抗体，然后分装于1.5ml 无菌塑料管中， 20储存备用。7再生 : 再以 0.1M 的柠檬酸（ PH3.0）缓冲液再生洗脱后的Pr
7、otein A Sepharose 4 Fast Flow 亲和层析柱，流速1ml/min ，体积 3-5ml。8保存：以含 20% 乙醇的 PBS （PH7.4） 平衡再生后的洗脱后的Protein A Sepharose 4 Fast Flow 亲和层析柱，流速1ml/min ，体积 30-50ml。关闭柱子，整体浸泡在含20%乙醇的 PBS （PH7.4）中， 4保存。注意事项：1本实验全过程应尽量在4下操作。2细胞上清必须高速离心并过滤，防止污染柱料。3防止柱子流干、冻冰。4上样液置于 4下上样，上样一段时间后流速将下降，应尽量排除柱内气体。5洗脱时，换洗脱缓冲液应注意排除凝胶表面前步
8、残留液体体积，防止影响洗脱效果。6流穿液和每步洗柱液应保留，待实验完毕后统一处理。结果观查及分析的原则采用分光光度计测 OD280， 按 1mg=1.35OD280计算抗体量。同时结合夹心 ELISA检测上样前与上样后嵌合抗体含量的变化，以计算上样结合量，得出纯化效率。实验成功或失败的关键因素pH 值在中性或碱性条件下， ProteinA 和人源抗体 Fc 段能够特异性结合，而在酸性条件下可以解离，因此洗涤液和洗脱液的pH 值是纯化成败关键。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -