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1、琼脂糖胶和PAGE 胶制备方法一、琼脂糖凝胶的特点天然琼脂（ agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose ，约占 80）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷， 而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。（1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。（2）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占9899），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品
2、吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。（3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。目前，常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA 鉴定， DNA 限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。二、 DNA 的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖
3、凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系（1）DNA 分子的大小在凝胶中， DNA 片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA 分子大小超过 20kb 时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA 时，分子大小不宜超过此值。（2）琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA 需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。表 琼脂糖浓度与DNA 分离范围
4、琼脂糖浓度 /0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状 DNA 大小/kb 605 201 100.8 70.5 60.4 40.2 30.1 2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系不同构型 DNA 的移动速度次序为：供价闭环DNA （covalently closed circular ，cccDNA ）直线 DNA 开环的双链环状DNA 。 当琼脂糖浓度太高时， 环状 DNA （一般为球形） 不能进入胶中， 相对迁移率为0 （Rm=0） ，而同等大小的直线双链DNA （刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也
5、受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。3、电泳方法（1）凝胶类型用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。（2）缓冲液系统缺少离子时，电流太小，DNA 迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA 的变性。常用的电泳缓冲液有EDTA （pH8.0）和 Tris- 乙酸（ TEA ），Tris- 硼酸（ TBE ）或 Tris- 磷酸（ TPE
6、）等，浓名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 3 页 - - - - - - - - - 度约为 50mmol/L(pH7.57.8) 。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。TAE 缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE 浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5 溶液，用时稀释10 倍 0.5 工作溶液即能提供足够缓冲能力。（3）凝胶的制备以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶
7、框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。（4）样品配制与加样 DNA 样品用适量 Tris-EDTA 缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25溴酚蓝或其他指示染料，含有10-15蔗糖或 510甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U 形条带，可改用 2.5Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。（5）电泳琼脂糖凝胶分离大分子DNA 实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA 片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA 片段
8、的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。电泳系统的温度对于DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5时，为增加凝胶硬度，可在4进行电泳。（6）染色和拍照常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA 条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。SDS-PAGE 胶制备一. 实验原理：SDS-PAGE 是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶
9、液中。 SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。二. 试剂和器材：试剂： 1. 5x 样品缓冲液（ 10ml）:0.6ml 1mol/L 的 Tris-HCl(pH6.8),5ml 50 甘油， 2ml 10的 SDS，0.5ml巯基乙醇， 1ml 1溴酚蓝， 0.9ml 蒸馏水。可在4保存数周，或在20保存数月。2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4保存，一般可放置1 个月。3. pH8.9 分离胶缓冲液：Tr
10、is 36.3g ，加 1mol/L HCl 48ml ，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4保存。4. pH6.7 浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加 1mol/L HCl 48ml ，加重蒸水80ml 使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4保存。5. TEMED （四乙基乙二胺）原液6.10过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris- 甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸 28.8g，加蒸馏水约900ml，调 pH8.3 后，用蒸馏水定容至 1000ml。置 4保存，临用前稀释10 倍。8. 考马斯亮蓝G250 染色液： 称
11、 100mg考马斯亮蓝G250，溶于 200ml 蒸馏水中， 慢慢加入 7.5ml 70的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌 1 小时，小孔滤纸过滤。器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 3 页 - - - - - - - - - 三. 实验操作；（一）样品制备将蛋白质样品与5X 样品缓冲液（ 20ul5ul）在一个 Eppendorf 管中混合。放入100加热 510min，取上清点样。（二）分离胶及浓缩胶的制备1 将玻璃
12、板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照 Bio-Rad Mini /说明书提示装好玻璃板；3 按如下体积配制10分离胶 8.0 ml，混匀；ddH2O 3.0 ml 1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml 30 Acr-Bis 2.8 ml 10 SDS 80 ul 10AP 56 ul TEMED 6 ul 4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min 后胶即可聚合；5 按如下体积配制6浓缩胶 3.0 ml，混匀； ddH2O 1.0 mol/LTris-HCl
13、pH=6.8 30 Acr-Bis 2.0 ml 400 ul 600 ul 10 SDS 10 AP TEMED 36ul 24ul 4ul 6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 l;8 稳压 200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min1hr. 9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色12 hr；加入脱色液，置于80 rpm 脱色摇床上 ,每 20 min 更换一次脱色液（ 10 ml 冰乙酸； 45 ml 乙醇； 45 ml 蒸馏水）至完全脱净。荧光显色开启显微镜汞灯；.根据样品标记的荧光素选择相应的滤光片；.
14、放好样品，找到合适的视野；.如需拍照，请确认照相机内已装好彩色胶卷（最好使用定胶卷） ； .开启自拍装置， 选择手动档， 通常拍摄速度在0.-0秒内；.使用结束，关闭所有电源并做好使用记录。如需详细说明，请借阅说明书。注：A为延长汞灯的使用寿命，汞灯开启不到分钟的请在分钟后关闭汞灯。B 在荧光状态下观察标本，标本内的荧光染色会较快的衰减，所以要避免长时间的在荧光下观察细菌菌落一般湿润，较光滑，较粘稠，易挑取，且菌落不是很大；放线菌菌落：菌落较细菌而言更小，干燥，不透明，表面呈致密的丝绒状，上有一层彩色的干粉，菌落与培养基连接紧密，难以挑去；酵母菌：细菌菌落类似，但一般较细菌菌落大且厚，表面湿润，粘稠，易被挑起，常见白色、土黄色、红色；霉菌的菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈绒毛状、絮状或网状等，菌体可沿培养基表面蔓延生长，菌落可呈红、黄、绿、青绿、青灰、黑、白、灰等多种颜色。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 3 页 - - - - - - - - -