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1、体内药物分析内源性活性物质的分析王伟王伟内源性活性物质1、定义内源性生物活性物质是指人类和哺乳动物体内天然存在的具有生理功能和生物学活性的物质，它们可以是小分子化学物质，也可能是糖类、生物活性肽类、核苷和核酸、生长因子、内源性调节因子、细胞因子和蛋白质等。2、研究意义 许多重大的突破都是由于发现了体内那些具有重要生理活性的物质，并发现调节这些物质的其它相关物质。基因克隆使“ 受体一指导” 和 “ 酶一指导” 的新药的发现在方法学上得到完善。D NA 重组和转基因技术的发展已使蛋白质和肽类药物的生产及其它内源性分子作为新药成为可能。蛋白质类内源性活性物质的分析Western Blot Weste
2、rn Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。荧光探针定义： 与蛋白质、核酸(DNA或RNA)或其他大分子结构非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改变的小分子物质。可用于研究大分子物质的性质和行为。 荧光探针 荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色、DNA电泳、核酸分子杂交、定量PCR技术以及DNA测序上都有着广泛的应用。 可以分为荧光素类探针、无机离子荧光探针、荧光量子点、
3、分子信标几类与G G蛋白偶联受体相关的内源性活性物质对心肌细胞功能和形态的影响免疫组织化学法 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 免疫化学技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。免疫组织化学染色法 免疫组织化
4、学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。 免疫组织化学染色法 免疫组织化学的优势在于专一性、灵敏度、简便快速以及成本低廉，所以广为医院采用，通常是借由特定的肿瘤标记来筛选癌症。免疫组织化学染色法对基础研究及预防和诊疗上都是相当重要的一个方法。发光免疫测定luminescence immunoassay;LIA;luminescent immunoassa
5、y 将发光系统与免疫反应相结合，用于检测抗原或抗体的技术。 以发光物质标记抗原或抗体，免疫反应后引发发光反应，根据发光强度对抗体或抗原进行的测定。 层析 chromatography 基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。 层析是应用蛋白质的等电点不同而分析分离蛋白质的。双向凝胶电双向凝胶电泳（泳（2D2D胶电泳）的胶电泳）的基本原理基本原理先将蛋白质根据其等电点在先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等
6、电聚焦，然后按照它们的梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进行相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。第二次电泳分离。第一向进行等电聚焦第一向进行等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白质具有两性解离，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性和等电点特性，将蛋白质样品加载至将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动带电荷相反的电极方向移动。移动过程中移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子蛋白分子可能获得或失去质子，并随并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降
7、。当蛋白迁移至其等电点着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点 pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电点点 pH 区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动。同样同样，如果蛋白如果蛋白质扩散到高于其等电点的质扩散到高于其等电点的 pH 区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极移区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄
8、的pH 梯度介质区梯度介质区域内。目前常使用预制胶条域内。目前常使用预制胶条 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白质的等电用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的聚焦分离，将聚焦好的 IPG 胶条在含有胶条在含有 SDS 的缓冲液中平衡。的缓冲液中平衡。第二向是将在第二向是将在 IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量 (MW) 大小与第一向相垂直的分离大小与第一向相垂直的分离。沿。沿垂直的方向进行垂直的方向进行 SDS-PAGE电泳（电泳
9、（聚丙烯酰氨凝胶电泳）聚丙烯酰氨凝胶电泳），按分子量大小进行按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。 IPG 胶的材料是胶的材料是 Immobilines，为拥有，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在基或叔氨基团，它们构成了分布在pH 310不同值的不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试试剂添加至混合物中用于凝胶聚合剂添加至混合物中
10、用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状分离达到真正的平衡状态。态。2D胶电泳数据库细胞因子的测定ELISAELISA系列的试剂盒 细胞因子绝大部分是蛋白质，并且一般都用ELISA试剂盒测定。ELISA法酶联免疫吸附剂测定是主要的测蛋白的方法ELISA 的原理ELISAELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗是以免疫学反应为基础，将抗原、抗
11、体的特异性反应与酶对底物的高效催化作体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种用相结合的一种 敏感性很高的实验技术。敏感性很高的实验技术。基础基础: :抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留其酶的抗体既保留其免疫学活性，又保留其酶的活性。活性。测定时，受检标本与固相载体表面的抗原测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应，洗涤加入酶标记抗原或抗或抗体起反应，洗涤加入酶标记抗原或抗体，
12、加入酶反应的底物后，底物被酶催化体，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。析。免疫测定在临床检验中的应用免疫测定在临床检验中的应用的可行性的可行性由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，尤其尤其采用基因工程方法制备包被抗原来检测样采用基因工程方法制备包被
13、抗原来检测样本中的相应抗体，都大大提高了本中的相应抗体，都大大提高了ELISAELISA的特异的特异性，加之电脑化程度极高的性，加之电脑化程度极高的ELISAELISA检测仪的使检测仪的使用，使用，使ELISAELISA更为简便实用和标准化，从而使更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。其成为最广泛应用的检测方法之一。综上，由于综上，由于ELISAELISA具有快速、敏感、简便、具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用和广泛应用 。举例：多糖蛋白的检测ELISA试剂盒法 CRP，肺炎球菌细胞壁c多糖蛋白，一种急
14、性时相（期）蛋白，亦称C反应蛋白，正常参考值10mg/L。本身由肝细胞产生能结合肺炎球菌细胞壁糖蛋白，能监测疾病的发展情况为非特异性的检验指标，很多疾病时都可以表现出来。RIA法儿 放射免疫测定/放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA) RIARIA法基本原理：法基本原理： 在放射免疫分析的实验中，加入超量的标记抗原*Ag与未标记抗原Ag（即：待测抗原）与较少量的抗体（Ab）竞争性结合。 如果实验结果所计量到的结合物（*Ag-Ab）放射活性较高，表示待测物的浓度较低。 如果所计量到的结合物放射活性较低，则表示待测物的浓度较高。 藉由标准 曲线图的分析，可以推算出待测物的浓度。
15、用 ELISA 法及 RIA 法检测活性蛋白及其降解产物的测定血浆纤维蛋白原水平与纤维蛋白 体聚合功能的测定血血浆纤维蛋白原降解产物测定浆纤维蛋白原降解产物测定参考值 5mg/L 意 义 1.增高见于原发性纤溶症,DIC(弥散性血管内凝血),恶性肿瘤,肝脏疾病,肾脏疾病,肺梗死,白血病,器官移植的排斥反应等.血血浆纤维蛋白原降解产物测定浆纤维蛋白原降解产物测定原理 将FDPs单抗色酸干酶标板,加入受检血清,血清中FDPs(抗原)与包被在反应板的FDPs单抗结合,然后再加入酶标记的FDPs抗体,与包被的FDPs结合,最后加入底物显色,显色深浅与血清中FDPs含量成正相关,所得的A值可从标准曲线中
16、计算出血清中FDPs的含量.炎症细胞因子在众多炎症细胞因子中，起主要作用的是TNF- 、IL-1、IL-6、TGF-、IL-8、IL-l0等。 TNF-是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性增加，调节其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。 IL一6能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应答，是炎性反应的促发剂。 IL-8能刺激中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的趋化，促进中性粒细胞脱颗粒，释放弹性蛋白酶，损伤内皮细胞，使微循环血流淤滞，组织坏死，造成器官功能损伤。 生物活性法儿测定验证因子具体举例
17、白介素-2(17到24张)本法系根据在不同白介素本法系根据在不同白介素-2 (IL-2)-2 (IL-2)的的浓度下，其细胞依赖株浓度下，其细胞依赖株CTLL-2CTLL-2细胞存活细胞存活率不同，以此检测率不同，以此检测IL-2IL-2的生物学活性。的生物学活性。 试剂试剂(1) RPMI1640(1) RPMI1640培养液培养液 取取RPMI 1640RPMI 1640培养培养基粉末基粉末1 1袋袋( (规格为规格为1L)1L)，加水溶解并稀释至，加水溶解并稀释至1000ml1000ml，加青霉素，加青霉素10105 5IUIU和链霉素和链霉素10105 5 IU IU，再加碳酸氢钠再加
18、碳酸氢钠2.1g2.1g，溶解后，混匀，除菌，溶解后，混匀，除菌过滤，过滤，44保存。保存。(2) (2) 基础培养液基础培养液 取新生牛血清取新生牛血清(FBS)(FBS) 10ml 10ml，加，加 RPMl 1640RPMl 1640培养液培养液90ml90ml。44保存。保存。(3)(3)完全培养液完全培养液 取基础培养液取基础培养液100ml100ml，加重组人自介素加重组人自介素-2-2至终浓度至终浓度400400800IU800IU。44保存。保存。(4) PBS(4) PBS 取氯化钠取氯化钠8.0g8.0g、氯化钾、氯化钾0.20g0.20g、磷酸氢二钠磷酸氢二钠1.44g1
19、.44g、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾0.24g0.24g，加，加水溶解并稀释至水溶解并稀释至1000ml1000ml，经，经121 15121 15分钟分钟灭菌。灭菌。(5)(5)噻唑蓝噻唑蓝(MTT)(MTT)溶液溶液 取取MTT 0.1gMTT 0.1g，加，加PBSPBS溶解并稀释成溶解并稀释成20ml20ml，经，经0.22pm0.22pm滤膜过滤滤膜过滤除菌。除菌。44避光保存。避光保存。(6)(6)裂解液裂解液 1515十二烷基硫酸钠溶液，十二烷基硫酸钠溶液，使用期限不得超过使用期限不得超过1212个月。个月。CTLL-2CTLL-2细胞细胞 应为偏酸性、略微浑浊液应为偏酸性、略微浑浊
20、液体，传代后体，传代后48486060小时用于重组人白介素小时用于重组人白介素- -2 2生物学活性测定。生物学活性测定。 标准品溶液的制备标准品溶液的制备 取重组人白介素取重组人白介素-2-2生物学活性测定的国家标准品，按使用说生物学活性测定的国家标准品，按使用说明书复溶后，用基础培养液稀释至每明书复溶后，用基础培养液稀释至每lmllml含含200IU200IU。在。在9696孔细胞培养板中，做孔细胞培养板中，做2 2倍系倍系列稀释，共列稀释，共8 8个稀释度，每个稀释度做个稀释度，每个稀释度做2 2个个孔。每孔分别留孔。每孔分别留50ul50ul标准品溶液，弃去孔标准品溶液，弃去孔中多余溶
21、液。以上操作在无菌条件下进行。中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。 供试品溶液的制备供试品溶液的制备 将供试品按标示将供试品按标示量复溶后，用基础培养液稀释成每量复溶后，用基础培养液稀释成每lmllml约约含含200IU200IU。在。在9696孔细胞培养板中。做孔细胞培养板中。做2 2倍倍系列稀释，共系列稀释，共8 8个稀释度，每个稀释度做个稀释度，每个稀释度做2 2孔。每孔分别留孔。每孔分别留50ul50ul供试品溶液，弃去供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进行。进行。 测定法测定法 CTLL-2CTLL-2细胞用完全培养液于细胞用完全培
22、养液于3737、5%5%二氧化碳条件下培养至足够量，二氧化碳条件下培养至足够量，离心收集离心收集CTLL-2CTLL-2细胞，用细胞，用 RPMI 1640RPMI 1640培培养液洗涤养液洗涤3 3次，然后重悬于基础培养液中次，然后重悬于基础培养液中配制成每配制成每lmllml含含6.O6.O10105 5个细胞的细胞悬个细胞的细胞悬液，置液，置3737、5 5二氧化碳条件下备用。二氧化碳条件下备用。在加有标准品溶液和供试品溶液的在加有标准品溶液和供试品溶液的9696孔孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液细胞培养板中，每孔加入细胞悬液50ul50ul，于于3737、5 5二氧化碳培养二氧化碳培养
23、18182424小时。小时。 然后每孔加入然后每孔加入 MTTMTT溶液溶液20ul20ul，于，于3737、5 5二氧化碳培养二氧化碳培养4 46 6小时后，每孔加入裂小时后，每孔加入裂解液解液150ul150ul，于，于3737、5 5二氧化碳条件下二氧化碳条件下保温保温18182424小时。以上操作均在无菌条件小时。以上操作均在无菌条件下进行。混匀细胞板中的液体，放入酶标下进行。混匀细胞板中的液体，放入酶标仪，以仪，以630nm630nm为参比波长，于波长为参比波长，于波长570nm570nm处处测定吸光度，记录测定结果。测定吸光度，记录测定结果。试验数据采用计算机程序或四参数回归计试验
24、数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果：算法进行处理。并按下式计算试验结果： DsDsEsEs 供试品生物学活性供试品生物学活性(IU/m1) = Pr(IU/m1) = Pr Dr DrErEr式中：式中：PrPr为标准品生物学活性，为标准品生物学活性，IUIUmlml； DsDs为供试品预稀释倍数；为供试品预稀释倍数； DrDr为标准品预稀释倍数；为标准品预稀释倍数； EsEs为供试品相当于标准品半效量的稀释为供试品相当于标准品半效量的稀释 倍数；倍数； Er Er为标准品半效稀释倍数。为标准品半效稀释倍数。基因测定测定基因可以更有力的说明基因表达的内源性活性物
25、质的存在1、PCR技术测基因2、运用荧光探针测定基因（原理见前述）3、免疫组织化学染色法（原理见前述）RNA的测定小分子化学物质的检测1、液质连用 液质联用（HLPC-MS）又叫液相色谱-质谱联用技术，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、食品分析和环境分析等许多领域得到了广泛的应用。应用： 更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。2、荧光分析无机离子荧光探针（如前述）胍丁胺是一种多胺，其结构与其它多胺相似，但其生物学功能复杂得多。胍丁胺的检测糖类的检测1、核糖2、体内一些活性酶是糖3、糖蛋白的检测用ELISA法