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1、20:171第第4讲讲 分子标记技术分子标记技术一、分子标记的相关知识一、分子标记的相关知识u遗传标记遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传任何一种遗传特性特性u两两个基本个基本特征特征: 可可遗传性遗传性和和可可识别性识别性u生物生物的任何有差异表型的基因突变型均可作的任何有差异表型的基因突变型均可作为为遗传标记遗传标记形态学标记（形态学标记（morphological marker）细胞学细胞学标记标记 (cytological marker)生化生化标记标记 (
2、biochemical marker)分子分子标记标记 (molecular marker)：DNA分子遗分子遗传标记，或传标记，或DNA标记。标记。l个体个体的外部的外部形态特征形态特征l简单简单直观、经济直观、经济方便方便l但数量但数量在多数有限、多态性在多数有限、多态性较差，表现易受环境影响，较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状并且有一些标记与不良性状连锁连锁。l形态形态标记的获得需要通过诱标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期变、分离纯合的过程，周期较长。较长。 l细胞细胞染色体的染色体的变异变异l包括染色体核型（染色体数目、包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无
3、、着丝粒位置等）结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（和带型（C C带、带、N N带、带、G G带等）的带等）的变变化化l能能进行一些重要基因的染色体或进行一些重要基因的染色体或染色体区域染色体区域定位定位l费时费力，技术有难度；有些费时费力，技术有难度；有些变变异难以用细胞学方法进行检测。异难以用细胞学方法进行检测。l同工酶或等位同工酶或等位酶标记酶标记。同工酶同工酶是指一个以上基因座位编码的酶的不是指一个以上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。同形式，而等位酶是指由一个基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。分析方法是电泳和组织
4、化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。分析方法是电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。l两两个方面的优点：个方面的优点：一一是共显性特性；是共显性特性；二是直接反映了基因产物二是直接反映了基因产物差异。差异。l应用应用有限：有限：一是可用标记数量少，二是染色方法和电泳技术有一定难度。一是可用标记数量少，二是染色方法和电泳技术有一定难度。能能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNADNA片段，它直接反映基因组片段，它直接反映基因组DNADNA间的差异间的差异。优越性。优越性表现为表现为：（1 1）直接以）直接以D
5、NADNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2 2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3 3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4 4）表现为中性，不影响目标性状的表达；）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5 5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体
6、和杂合体。 突变突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。 多态性多态性(Polymorphism)群体内同一DNA序列的两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每100010000个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。第第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括包括RFLP、DNA指纹技术（指纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交（）、原位杂交（in situ hybridizat
7、ion）等；）等；第二类是以第二类是以PCR为核心的分子标记技术，为核心的分子标记技术，包括包括RAPD、简单序列重复标记简单序列重复标记SSR或简单序列长度多态性（或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称简称SSLP标记）、标记）、扩增片段扩增片段长度多态性标记长度多态性标记AFLP、序标位、序标位STS、序列特征化扩增区域、序列特征化扩增区域SCAR等；等；第三类第三类是基于是基于 DNA序列和芯片的分子标记，序列和芯片的分子标记，如：如：SNP标记、表达序列标签标记、表达序列标签EST标记等。标记等。l RFLP（Restric
8、tion fragment length polymorphism,即限制性长度片段多态性） l 原位杂交（in situ hybridization）第第一类：一类：基于核酸杂交基于核酸杂交的分子的分子标记标记RAPD （Random amplified polymorphic DNA）DAF（DNA amplification fingerprinting）SSCP（Single strand confirmational polymorphism） 小卫星小卫星DNA（Minisatellite DNA）微卫星微卫星DNA（Microsatellite DNA）,又称SSR（Simple
9、 sequence repeat）ISSR（Inter simple sequence repeat）AP-PCR（Arbitrary primer PCR）SCAR（Sequence characterized amplified region）STS (Sequence tagged site)基于基于PCR技术的技术的DNA扩增方法扩增方法第二第二类：类：基于基于 PCR的分子的分子标记标记l AFLP（Amplified fragment length polymorphism） AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增 l CAPS（Cleaved amplified polym
10、orphic sequence） CAPS是先扩增，再酶切扩增片段PCR与酶切相结合的方法与酶切相结合的方法l SNP（Single nucleotide polymorphism）l 表达序列标签表达序列标签EST标记标记第三第三类：类：基于基于 DNA序列的序列的分子分子标记标记CAPACITY1985199019952000Multi-SSRsAFLPsSSRsRAPDsRFLPsSNPsHiSpeed sequSRAP, TRAP二、几种分子标记介绍二、几种分子标记介绍英文缩写英文缩写英文名称英文名称中文名称中文名称RFLPRestriction fragment Iength pol
11、ymorphism限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性STSSequence tagged site序列标签位点序列标签位点RAPDRandom amplified polymorphic DNA随机扩增多态性随机扩增多态性DNAAFLPAmplified frangment lengthPolymorphism扩增片断长度多态性扩增片断长度多态性SSRSimple sequence repeat简单序列重复简单序列重复SNPSimple mucleotide polymorphism单核苷酸多态性单核苷酸多态性几种主要的分子标记几种主要的分子标记1.限制性片段长度多态性标记限制性片段长度
12、多态性标记Restriction Fragment Length Polymorphisml RFLPRFLP：限制性片段长度多态性，为第一代多态性：限制性片段长度多态性，为第一代多态性记记l 原理原理：RFLPRFLP是由于染色体上单核甘酸突变或插入及缺是由于染色体上单核甘酸突变或插入及缺失突变导致限制性酶切位点的增加或减少，失突变导致限制性酶切位点的增加或减少，从而引起从而引起DNADNA酶切片段长度的变化，这种变化的检测通常是应酶切片段长度的变化，这种变化的检测通常是应用同位素或酶联免疫标记探针进行检测用同位素或酶联免疫标记探针进行检测。RFLP原理示意图GTAGTCGATTGTCGAG
13、AATTCGTCGGTGGTAAGCATCAGCTAACAGCTCTTAAGCAGCCACCATTC EcoRIEcoRI酶切位点单碱基突变导致酶切位点单碱基突变导致RFLP多态性多态性lRFLPRFLP是由是由DNADNA序列的序列的变异造成的。然而，如果变异造成的。然而，如果DNADNA变异的位点不变异的位点不在内切酶位点，变异则很难被检测到，这个缺陷可以用增加内在内切酶位点，变异则很难被检测到，这个缺陷可以用增加内切酶的种类来弥补。切酶的种类来弥补。l在在实际工作中，单一酶切产生的多态性极其有限实际工作中，单一酶切产生的多态性极其有限，可用，可用到到6 6到到8 8种酶来筛选多态性。不同
14、的酶产生的多态性大不相同。种酶来筛选多态性。不同的酶产生的多态性大不相同。技术路线：技术路线：不同个体不同个体DNA的提取的提取酶切酶切凝胶电泳分开凝胶电泳分开DNA片段片段转膜转膜 Southern杂交杂交 数据分析数据分析RFLP显性标记显性标记or共显性标记共显性标记RFLP的特点的特点A、不受环境条件和发育阶段的影响、不受环境条件和发育阶段的影响B、是、是共显性共显性的，可的，可区分纯合子和杂合子区分纯合子和杂合子C、需要对探针进行标记，还要需要对探针进行标记，还要Southern 杂杂交，耗时费力交，耗时费力D、DNA需要量大，难以用于大规模的育种需要量大，难以用于大规模的育种RFL
15、P研究的发展基因组基因组DNA酶切对象酶切对象PCR产物产物末端荧光标记末端荧光标记的的PCR产物产物RFLPPCR-RFLPTRFPGe et al. 2001. Genome 44: 1136-1142Identification of rice genomes by PCR-RFLP of Adh genes TRFPTerminal restriction fragment patterns欧洲帚石楠欧洲帚石楠2.2.随意扩增多态性随意扩增多态性DNADNA标记标记RAPDRAPDRandom Amplified Polymorphismic DNAl原理：原理：由由单个短单个短的的随
16、机随机序列序列引物（引物（10bp10bp）对）对基因组基因组进行进行PCRPCR扩增，当两个反向互补引物结合位点间距离扩增，当两个反向互补引物结合位点间距离满足满足PCRPCR扩增条件，就可以产生扩增片段扩增条件，就可以产生扩增片段。lRAPDRAPD扩增产物的多态性是由于引物结合位点或结合扩增产物的多态性是由于引物结合位点或结合位点位点间发生间发生了重排、缺失或突变导致扩增产物的缺了重排、缺失或突变导致扩增产物的缺失。失。MMRAPD原理示意图4/50RAPD 实验流程实验流程DNA提取PCR扩增产物检测数据记录电泳图RAPD 数据记录数据记录0 1矩阵矩阵显性标记显性标记有有有有有有有有
17、无无有有12/50RAPD RAPDrandom amplified polymorphic DNA10碱基Williams et al. 1990 AP-PCRarbitrary primer PCR20, 30碱基Welsh et al. 1990 DAFDNA amplification fingerprinting5, 8个碱基Caetano-Anolles et al. 1991RAPD标记的特点有：标记的特点有：（1）不需）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；）显性遗传（极少数共显性）
18、，不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。）实验重复性较差，结果可靠性较低。 3.扩增片段长度多态性标记扩增片段长度多态性标记AFLPAmplified Fragment Length Polymorphisml 1992年年，荷兰荷兰科学家科学家Zabeau和和Vosl 由于由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可
19、通过选择性的少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。扩增而检测。AFLP是在是在RFLP的基础上发展起来的的基础上发展起来的，差别在于检测手段。，差别在于检测手段。l AFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合组合。原理示意图原理示意图AFLP技术路线 1.基因组基因组DNA被酶切成小片段：被酶切成小片段：通常用一个四个通常用一个四个碱基识别位点的限制性内切酶如碱基识别位点的限制性内切酶如MseI和一个六个和一个六个碱基识别位点的酶如碱基识别位点的酶如EcoRI，其中，其中MseI确保产生确保产生合适大小的合适大小的DNA片段，这
20、些片段能在序列胶上进片段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离；而六碱基识别位点酶行有效的分离；而六碱基识别位点酶EcoRI能够限能够限制扩增片段数目，确保制扩增片段数目，确保DNA多态性的正常检测；多态性的正常检测； 2.接头与酶切片段的连接：接头与酶切片段的连接：接头序列包括：一个核接头序列包括：一个核心序列和酶切位点特异序列，心序列和酶切位点特异序列，MseI接头接头和和EcoRI接头，核心序列是一段已知的接头，核心序列是一段已知的20核甘酸的核甘酸的DNA序序列；列； 3.预扩增：预扩增：应用一对引物对酶切片段进行第一轮应用一对引物对酶切片段进行第一轮扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，
21、扩增引扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，扩增引物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端为为EcoRI切点，一端为切点，一端为MseI切点的切点的DNA酶切片段酶切片段，同时也与选择核甘酸配对的，同时也与选择核甘酸配对的DNA序列才能被扩序列才能被扩增。增。13步的产物可以通过步的产物可以通过Agarose胶检测。胶检测。 4.选择扩增：选择扩增：应用含有接头序列和三个选择核甘应用含有接头序列和三个选择核甘酸序列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，酸序列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，进一步降低扩增片段数量，同时一个引物被同位进一步降低扩增片段数
22、量，同时一个引物被同位素或荧光染料标记（也可用银染），电泳后压片素或荧光染料标记（也可用银染），电泳后压片检测检测。AFLP电泳图select 20 polymorphism markers from 256 primers1 2 31 2 31 2 31 2 3优点1）非常高的基因型分析效率非常高的基因型分析效率；2）典型的）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在分析，每次反应产物的谱带在50-100条之条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；极高；3）不需要基因组）不需要基因组DNA序列信息；序列信息；4）AFLP分析只需
23、要很少量的分析只需要很少量的DNA；(typically 0.2 to 2.5 g per individual)；5）AFLP可应用于任何可应用于任何生物生物；6）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传。）表现共显性，呈典型孟德尔式遗传。缺点1）需要高质量的）需要高质量的DNA，以确保酶切完全；，以确保酶切完全；2）从单个多态性）从单个多态性DNA片段开发位点特异性标记相当困难；片段开发位点特异性标记相当困难；3）多数情况下采用的是同位素标记；）多数情况下采用的是同位素标记；4）在染色体上不均匀分布，）在染色体上不均匀分布，AFLP标记经常在着丝粒附近区标记经常在着丝粒附近区域高度聚集域高度聚集AF
24、LP标记技术的应用l遗传连锁图谱的构建遗传连锁图谱的构建l亲缘关系和遗传多样性的研究亲缘关系和遗传多样性的研究l种质资源鉴定种质资源鉴定l分子标记辅助选择育种分子标记辅助选择育种l基因表达和基因克隆基因表达和基因克隆4.简单简单重复序列标记重复序列标记SSR（simple sequence Repeats） 或者称为微卫星或者称为微卫星DNA（microsatellite DNA） 原理：原理： 微卫星微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在重复序列，每个重复单元的长度在15bp之间，常见的微卫之间，常见的微
25、卫星如星如 (TG)n、 (GA)n、(AAT)n或或 (GACA)n等，不同数目的等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。 SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列座位的侧翼序列(Flanking Region)，寻找其中的特异保守区。，寻找其中的特异保守区。技术路线技术路线： 建立建立DNA文库文库 筛选鉴定微卫星筛选鉴定微卫星DNA克克隆隆 测定这些克隆的侧翼序列测定这些克隆的侧翼序列 设设计特异性引物
26、来扩增计特异性引物来扩增SSR序列序列 经经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色 比较谱带比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。座位上的多态性。 SSR电泳图SSR分子标记的应用举例鹅掌楸种属及杂种的分子标记鹅掌楸基因组鹅掌楸基因组DNA的提取的提取北美鹅掌楸北美鹅掌楸EST序序列中开发的列中开发的EST-SSR引物引物引物筛选引物筛选物种特异性扩增物种特异性扩增引物特异性验证引物特异性验证引物筛选随机选取鹅掌、楸北美随机选取鹅掌、楸北美鹅掌楸各四个样本鹅掌楸各四个样本176对引物对引物PCR扩增扩增挑选选留扩增条带挑
27、选选留扩增条带清晰且有明显多态清晰且有明显多态性片段的引物引物性片段的引物引物8对对用鹅掌楸、北美鹅用鹅掌楸、北美鹅掌楸、杂交鹅掌掌楸、杂交鹅掌楸各楸各30个基因型个基因型再次筛选再次筛选一对特异性引物一对特异性引物物种特异性扩增筛选的一对引物鹅掌楸基因北美鹅掌楸基因190bp180bp特异性扩增引物特异性验证鹅掌楸杂交鹅掌楸北美鹅掌楸190bp190bp和180bp180bp与一对引物特异性扩增 SSR 标记技术的特点有特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；
28、）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。引物引物设计设计二三一从有关数据库（从有关数据库（GenBank, EMBL DDBJ等）或文章中等）或文章中查询查询使用近缘种的引物使用近缘种的引物构建基因组文库构建基因组文库,筛选筛选SSR位点位点SSRSSR分子标记分子标记引物设计引物设计构建基因组文库构建基因组文库,筛选筛选SSR位点位点5锚定锚定PCR 分离分离SSR标记标
29、记l 锚定引物扩增l 用T载体克隆PCR产物，然后用Southern杂交的方法，在高严谨度的条件下，获得含微卫星序列的克隆，然后对这些阳性克隆进行测序，根据获得的序列，在微卫星序列的侧翼设计引物，用5锚定简并引物结合微卫星特异性引物，经扩增后获得单位点的SSR标记l 也可以通过步查获得微卫星序列另一侧的序列，并设计另一个引物，然后用成对的特异性引物来扩增单个微卫星位点5锚定锚定PCR技术有两个明显的技术有两个明显的优势：优势：第第一一，可以简单而快捷地建立，可以简单而快捷地建立SSR富集富集文库文库第二第二，对于大多数位点仅仅需要一个特异性引物，对于大多数位点仅仅需要一个特异性引物就可以获得位
30、点特异的共显性标记。因此在以后就可以获得位点特异的共显性标记。因此在以后开发的分离单位点微卫星序列的方法中很多都运开发的分离单位点微卫星序列的方法中很多都运用了这种用了这种引物。引物。基于全基因组的计算机自动化计算机自动化SSR标标记筛选方法记筛选方法几种分子标记技术的特点比较几种分子标记技术的特点比较5. ISSR 标记技术标记技术Inter Simple Sequence Repeat l ISSR，即内部，即内部简单简单重复序列重复序列l 1994，Zietkiewicz et al. l 用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物用加锚定的微卫星寡核苷酸作引物, 对与锚定引物对与锚定引物互补的间隔
31、不太大的重复序列间的基因组节段进互补的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行行PCR 扩增扩增l ASSR或或AMP-PCRISSR的分子基础的分子基础ISSR分子标记的特点l 实验实验成本低；成本低；l 操作简单，检测操作简单，检测方便方便；l 实验实验稳定性高；稳定性高；l 物种物种间通用；间通用；l 多态性多态性较高；较高；l 精确度精确度高；高；l 显性标记。显性标记。6.SNP分子标记分子标记SNP（Single nucleotide polymorphism）个体间基因组个体间基因组DNA序列同一位置单个核序列同一位置单个核苷酸变异苷酸变异(替换替换、插入或缺失、插入或缺失)所引起
32、的所引起的多态性。多态性。SNP基因编码区基因编码区SNPs（cSNPs）基因基因周边周边SNPs （pSNPs）基因基因间间SNPs （iSNPs）同义同义cSNP(synonymous cSNP)非同义非同义cSNP(non-synonymous cSNP)SNP的分类的分类cSNPsSNP的检测方法 SNPs 检测分析技术 在已知 DNA 序列数据库中筛选 以 DNA 构象为基础的方法 直接进行 DNA 测序的方法 以杂交为基础的方法 基于酶切或 PCR的方法 毛细管电泳方法 Polybayes 计算法 SNP pipeline 温度梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳 单链构象多态性 变性高
33、效液相色谱检测 限制性片段长度多态性 随机扩增多态性 突变错配扩增检验 测序 SNaPshot 等位基因特异寡核苷酸片段分析 基因芯片技术 毛细管电泳技术 针对目标针对目标SNP位点，直接设计合适引物扩增得到含突变位点的位点，直接设计合适引物扩增得到含突变位点的PCR产物，产物，经序列测定得到位点信息，属经序列测定得到位点信息，属SNP分析的分析的金标准金标准。 SNP 优点优点l特异性的l共显性l基因有功能意义 缺点缺点l引物设计困难显性与共显性显性与共显性180bp210bpRAPD 显性显性SNP 共显性共显性7.EST标记l EST (表达序列标签表达序列标签,Expressed Sq
34、uence tags)是从一是从一个随机选择的个随机选择的cDNA 克隆进行克隆进行5端和端和3端单一次测端单一次测序获得的短的序获得的短的cDNA 部分部分序列（一序列（一个完整基因的个完整基因的一小部分一小部分,在数据库中其长度一般从在数据库中其长度一般从20 到到7000bp 不等不等,平均长度为平均长度为360 120bp ）。）。l 1990s，Graig Venter提出了提出了EST的概念，并进行了的概念，并进行了609条人脑组织的条人脑组织的EST测序，测序，宣布了宣布了cDNA大规模测大规模测序的时代的开始（序的时代的开始（Adams et al.，1991）AAAAAAAA
35、AAAAmRNAPrimer/Reverse transcriptase获取EST的技术路线5 staggered length cDNAs due to polymerase processivityCloning and sequencingcDNAs3 EST5EST20:17748.其它分子标记其它分子标记l RGAs标记标记l RMAPD标记标记l SRAP标记标记l TRAP标记标记20:1775RGAs 标记标记( Resistance Gene Analogs ,抗病基因抗病基因类似物类似物) RGAs 是用基于抗病基因保守序列设计的引物扩是用基于抗病基因保守序列设计的引物扩增
36、基因组得到的抗病基因类似序列的分子标记。增基因组得到的抗病基因类似序列的分子标记。RMAPD标记（标记（random microsatellite amplify polymorphic DNA ,随机微卫星扩增多肽）随机微卫星扩增多肽） 利用利用RAPD RAPD 引物和微卫星上游或下游引物结合引物和微卫星上游或下游引物结合, ,对对基因组基因组DNA DNA 进行扩增进行扩增, , 获得获得DNA DNA 多态性的分子标记多态性的分子标记。20:1776SRAP标记（标记（Sequence Related Amplified Polymorphism , 相关序列扩增多态性）相关序列扩增多
37、态性）l SRAP 标记是基于标记是基于PCR 技术的分子标记技术技术的分子标记技术l 利用基因外显子里利用基因外显子里G、C 含量丰富含量丰富,而启动子和而启动子和内含子里内含子里A、T 含量丰富的特点设计两套引物含量丰富的特点设计两套引物,对对开放阅读框架进行扩增开放阅读框架进行扩增。20:1777TRAP标记（标记（Target Region Amplified Polymorphism ,靶位区域扩增多态性）靶位区域扩增多态性）l TRAP 是从是从SRAP 技术改进而来的分子标记技术技术改进而来的分子标记技术l 借助大规模测序技术产生的庞大生物序列信息借助大规模测序技术产生的庞大生物序列信息,利利用生物信息学工具和表达序列标签数据库信息设计用生物信息学工具和表达序列标签数据库信息设计引物引物,对对目标候选基因序列区目标候选基因序列区进行进行PCR 扩增产生多扩增产生多态性标记。态性标记。20:1778理想的分子标记？理想的分子标记？20:1779