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1、 含量及有关物质含量及有关物质分析方法验证的可接受标准分析方法验证的可接受标准文章来源：药审中心文章来源：药审中心 审评二部审评二部黄晓龙黄晓龙 本文介绍了在对含量及有关物质测定所用的本文介绍了在对含量及有关物质测定所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接可接受标准受标准，以利于判断该分析方法的可行性。，以利于判断该分析方法的可行性。 内容包括：准确度、线性、精密度、专属性、内容包括：准确度、线性、精密度、专属性、检测限、定量限、耐用性和系统适应性检测限、定量限、耐用性和系统适应性 。1.准确度准确度含量：含量：l该指标主要是通过回收率来反映。验证时一
2、般该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为要求分别配制浓度为80、100和和120的供的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。与理论值比较，计算回收率。 可接受的标准可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均为：各浓度下的平均回收率均应在应在98.0%-102.0%之间，之间，9个回收率数据的相个回收率数据的相对标准差（对标准差（RSD）应）应不大于不大于2.0%。 l有关物质：有关物质： 验证时一般要求根据验证时一般要求根据有关物质的定量限与质有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度量标准中该杂质的限度分别配
3、制三个浓度的供分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为则可分别配制该杂质浓度为0.1、0.2和和0.3的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收个回收率数据的率数据的RSD。准确度准确度 可接受的标准可接受的标准为：各浓度下的平均回收率为：各浓度下的平均回收率均应在均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为之间，如杂质的浓度为定量定量限限，则该浓度下的平均回收率可放宽至，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-
4、130%，相对标准差，相对标准差应不大于应不大于10%。 准确度准确度2.线性线性l含量：含量： 线性一般通过线性回归方程的形式来表示。线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：具体的验证方法为：在在80至至120的浓度范的浓度范围内配制围内配制6份份浓度不同的供试液，分别测定其浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，主峰的面积，计算相应的含量计算相应的含量。以。以含量为横坐含量为横坐标标（X），峰面积为纵坐标（），峰面积为纵坐标（Y），进行线性），进行线性回归分析。回归分析。 l 可接受的标准为：可接受的标准为：回归线的相关系数（回归线的相关系数（R）不不得小于得小于0.998
5、，Y轴截距应在轴截距应在100响应值的响应值的2以内以内，响应因子响应因子的相对标准差的相对标准差应不大于应不大于2.0%。 线性线性l有关物质：有关物质： 在在定量限至一定的浓度范围定量限至一定的浓度范围内配制内配制6份浓份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量计算相应的含量。以含量为横坐标（。以含量为横坐标（X），峰），峰面积为纵坐标（面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。），进行线性回归分析。 可接受的标准为：相关系数（可接受的标准为：相关系数（R）不得小不得小于于0.990，Y轴截距应在轴截距应在100响应值的响应值的25以以内
6、内，响应因子的相对标准差应，响应因子的相对标准差应不大于不大于10%。 线性线性3.精密度精密度 含量：含量： 1）重复性重复性 配制配制6份相同浓度的供试品溶液，份相同浓度的供试品溶液，由一个分析由一个分析人员在尽可能相同的条件下人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得进行测试，所得6份份供试液含量的相对标准差供试液含量的相对标准差应不大于应不大于2.0%。 2）中间精密度中间精密度 配制配制6份相同浓度的供试品溶液，份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于个含量数据的相对
7、标准差应不大于2.0%。l有关物质：有关物质： 1）重复性）重复性配制配制6份杂质浓度（一般为份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差份供试液含量的相对标准差应应不大于不大于15%。 2）中间精密度）中间精密度配制配制6份杂质浓度（一般为份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准个含量数据的相对标准差
8、差应不大于应不大于20%。精密度精密度4.专属性专属性l含量：含量： 可接受的标准为：空白对照应无干扰，主可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于小于2.0。以二极管阵列检测器进行纯度分析。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于时，主峰的纯度因子应大于980。 l有关物质：有关物质： 可接受的标准为：空白对照应无干扰，该可接受的标准为：空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于于2.0。 5.检测限检测限l含量：含量： 主峰与噪音峰信号的强
9、度比应主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于不得小于3 。l有关物质：有关物质： 杂质峰与噪音峰信号的强度比应杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于不得小于3。6.定量限定量限l含量：含量： 主峰与噪音峰信号的强度比应主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于不得小于10。另外，配制另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，份最低定量限浓度的溶液，所测所测6份份溶液溶液主峰的保留时间主峰的保留时间的相对标准差应不大于的相对标准差应不大于2.0%。 l有关物质：有关物质： 杂质峰与噪音峰信号的强度比应杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于不得小于10。另外，配制另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测份最低定量限浓度
10、的溶液，所测6份份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于峰面积的相对标准差应不大于5.0%。 7.耐用性耐用性l含量：含量： 分别考察流动相比例变化分别考察流动相比例变化5、流动相、流动相pH值变化值变化0.2、柱温变化、柱温变化5、流速相对、流速相对值变化值变化20时，仪器色谱行为的变化，时，仪器色谱行为的变化，每个每个条件下各测试两次。条件下各测试两次。可接受的标准为：主峰的可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据到基线分离；各
11、条件下的含量数据（n=6）的的相对标准差应不大于相对标准差应不大于2.0%。 l有关物质：有关物质： 分别考察流动相比例变化分别考察流动相比例变化5、流动相、流动相pH值变化值变化0.2、柱温变化、柱温变化5、检测波长变化、检测波长变化5nm、流速相对值变化、流速相对值变化20以及采用三根不以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下化，每个条件下各测试两次各测试两次。可接受的标准为：。可接受的标准为：各杂质峰的拖尾因子不得大于各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含
12、量成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（数据（n=6）的相对标准差应不大于）的相对标准差应不大于2.0%，杂质杂质含量的绝对值在含量的绝对值在0.1以内。以内。 耐用性耐用性8.系统适用性系统适用性l含量：含量： 配制配制6份相同浓度的供试品溶液进行分析，份相同浓度的供试品溶液进行分析，主峰峰面积的相对标准差应不大于主峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主，主峰保留时间的相对标准差应不大于峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另。另外，主峰的拖尾因子不得大于外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂，主峰与杂质峰必须达到基线分离，主峰的理论塔板数应质峰必须达到基线分离，主峰的理论
13、塔板数应符合质量标准的规定。符合质量标准的规定。 l有关物质：有关物质： 配制配制6份相同浓度的杂质溶液进行分析，份相同浓度的杂质溶液进行分析，该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于该杂质峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，保留时间的相对标准差应不大于保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，。另外，杂质峰的拖尾因子不得大于杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，理论塔板数，理论塔板数应符合质量标准的规定。应符合质量标准的规定。 系统适用性系统适用性9.溶液稳定性溶液稳定性l有关物质：有关物质： 按照分析方法分别配置按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品对照品溶液与供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质
14、的含量，溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，然后然后将上述溶液分别贮存在将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室（室温与冰箱冷藏室（4）中，在中，在1、2、3、5和和7天天时分别平行测定两次主时分别平行测定两次主成分与杂质的含量。成分与杂质的含量。可接受的标准为：主成分的可接受的标准为：主成分的含量变化的绝对含量变化的绝对值值应不大于应不大于2.0%，杂质含量的绝对值杂质含量的绝对值在在0.1以内，以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。并不得出现新的大于报告限度的杂质。 化学药品溶出度方法研究化学药品溶出度方法研究文章来源：审评二部文章来源：审评二部 唐素芳唐素芳化学药品普通口服固体制剂化学药
15、品普通口服固体制剂溶出度方法验证易忽视的几个问题溶出度方法验证易忽视的几个问题文章来源：文章来源：审评四部审评八室审评四部审评八室 郑国钢郑国钢溶出度研究试验主要包括以下内容：溶出度研究试验主要包括以下内容： （1）溶出介质的选择）溶出介质的选择 （2）溶出介质体积的选择溶出介质体积的选择 （3）溶出方法（转篮法与桨法）的选择）溶出方法（转篮法与桨法）的选择 （4）转速的选择）转速的选择 （5）溶出度测定方法的验证）溶出度测定方法的验证 （6）溶出度均一性试验（批内）溶出度均一性试验（批内） （7）重现性试验（批间）重现性试验（批间）（1）溶出介质的选择）溶出介质的选择 溶出介质通常采用水、溶
16、出介质通常采用水、0.1mol/L盐酸溶液、盐酸溶液、缓冲液（缓冲液（pH值值38为主为主）。对在上述溶出介）。对在上述溶出介质中均不能完全溶解的难溶性药物，可加入质中均不能完全溶解的难溶性药物，可加入适适量量的表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（的表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（0.5%以下）等，以下）等，应有文献依据，并尽量选用低浓度，应有文献依据，并尽量选用低浓度，必要时应做生物利用度考察。必要时应做生物利用度考察。 （2）溶出介质体积的选择）溶出介质体积的选择 溶出介质的体积需使药物符合溶出介质的体积需使药物符合漏槽条件漏槽条件，大杯法（第一、二法）常用体积为大杯法（第一、二法）常用体积为50
17、0、900和和1000ml，小杯法（第三法）常用体积为，小杯法（第三法）常用体积为100250ml。部分品种为满足在溶出量测定。部分品种为满足在溶出量测定时药物浓度的需要，可采用低于上述限度范围时药物浓度的需要，可采用低于上述限度范围的溶剂。的溶剂。 漏槽条件漏槽条件即做溶出的最佳条件，是指药物即做溶出的最佳条件，是指药物所处释放介质的浓度远小于其饱和浓度，生理所处释放介质的浓度远小于其饱和浓度，生理学解释为药物在体内被迅速吸收，制剂的体外学解释为药物在体内被迅速吸收，制剂的体外包括释放度等测定需要模仿体内生理条件的，包括释放度等测定需要模仿体内生理条件的，满足药物溶解满足药物溶解-吸收的过程
18、，漏槽条件起到了吸收的过程，漏槽条件起到了修正作用，修正作用，一般释放介质的体积为药物饱和溶一般释放介质的体积为药物饱和溶液所需介质体积的液所需介质体积的35倍。倍。溶出介质体积的选择溶出介质体积的选择（3）转篮法与桨法的选择）转篮法与桨法的选择 一般情况下，一般情况下，片剂多选择桨法，转篮法片剂多选择桨法，转篮法多用于胶囊剂或漂浮的制剂多用于胶囊剂或漂浮的制剂，研究资料应进，研究资料应进行两种方法的对比试验，以确定最佳方法。行两种方法的对比试验，以确定最佳方法。 （4）转速的选择）转速的选择 目前，各国药典中收载的溶出度测定方法中目前，各国药典中收载的溶出度测定方法中的转速，大部分在的转速，
19、大部分在50100转转/分。转篮法以分。转篮法以100转转/分为主；桨法以分为主；桨法以50转转/分为主。分为主。一般认为桨法一般认为桨法50转转/分相当于转篮法分相当于转篮法100转转/分。分。转速的设置与具转速的设置与具体品种有关，通常，药物制剂的溶出速度随着转体品种有关，通常，药物制剂的溶出速度随着转速的增加而增大。转速过快，可能会导致对不同速的增加而增大。转速过快，可能会导致对不同制剂溶出行为的区分能力差，所以制剂溶出行为的区分能力差，所以不推荐选择过不推荐选择过高转速。高转速。转速的选择应以能区分不同处方和生产转速的选择应以能区分不同处方和生产工艺的产品为宜，工艺的产品为宜， 如如确
20、实需要选择高转速，应进确实需要选择高转速，应进行充分的验证。行充分的验证。 （5）溶出度测定方法的验证）溶出度测定方法的验证 方法学验证内容与含量测定基本相同。应方法学验证内容与含量测定基本相同。应该注意的是，在方法学验证中，该注意的是，在方法学验证中，试验所用的溶试验所用的溶媒应为溶出介质媒应为溶出介质，即应考查辅料、胶囊壳在溶，即应考查辅料、胶囊壳在溶出介质中的干扰，药物在溶出介质中的线性、出介质中的干扰，药物在溶出介质中的线性、回收率及稳定性等。回收率及稳定性等。 应该注意的问题：应该注意的问题：1. 对于溶出度，对于溶出度，范围规定为限度的范围规定为限度的20（回收率高、中、低常设为（
21、回收率高、中、低常设为50、限度浓度、限度浓度、100）。）。 2. 测定干扰测定干扰2%以下可忽略不计，以下可忽略不计，25%可可考虑在限度上适当提高，超过考虑在限度上适当提高，超过5%以上测定方法以上测定方法不可取，不可取，如是空胶囊产生的应进行囊壳的消除如是空胶囊产生的应进行囊壳的消除试验。试验。如空胶囊干扰大于标示量的如空胶囊干扰大于标示量的25%，实验，实验无效，如干扰不大于标示量的无效，如干扰不大于标示量的2% ,可忽略不计。可忽略不计。 溶出度测定方法的验证溶出度测定方法的验证3.滤膜吸附的验证滤膜吸附的验证 一般认为吸附量在一般认为吸附量在2%以下时可忽略不计，以下时可忽略不计
22、，超过超过2%时应考虑选用其他滤过方法或更换适宜时应考虑选用其他滤过方法或更换适宜的溶出介质。的溶出介质。 溶出度测定方法的验证溶出度测定方法的验证（6）取样点和限度的确定）取样点和限度的确定 通过溶出度通过溶出度均一性试验均一性试验（ 考察同一批样考察同一批样品的溶出曲线）和品的溶出曲线）和重现性试验重现性试验（ 考察至少考察至少3批批样品的溶出曲线），确定合理的溶出度测定取样品的溶出曲线），确定合理的溶出度测定取样点和限度。为避免多次取样造成的误差，测样点和限度。为避免多次取样造成的误差，测定溶出曲线时取样点不宜过多，通常为定溶出曲线时取样点不宜过多，通常为56个个点，小规格的制剂因采用点
23、，小规格的制剂因采用100250 ml溶出介溶出介质，所以溶出曲线一般可选质，所以溶出曲线一般可选34个时间点。个时间点。限限度应综合考虑溶出曲线拐点和一般性要求。度应综合考虑溶出曲线拐点和一般性要求。 总结及个人观点：总结及个人观点：1. 在进行分析方法的验证时，首先还是要参在进行分析方法的验证时，首先还是要参考考中国药典和指导原则中国药典和指导原则，文章中提到的试验方，文章中提到的试验方法和可接受标准也是专家的一些经验总结，我法和可接受标准也是专家的一些经验总结，我们在进行研究时应根据具体的项目分析参考。们在进行研究时应根据具体的项目分析参考。 2. 在在耐用性耐用性试验时，文中要求每个条
24、件下试验时，文中要求每个条件下各各测试两次，测试两次，且每次要平行测定且每次要平行测定6份份样品样品？3. 在进行溶出度测定方法的选择时，仅考在进行溶出度测定方法的选择时，仅考虑不同条件下单点的溶出度是不合适的，虑不同条件下单点的溶出度是不合适的，应应结合溶出曲线的测定结果来确定。结合溶出曲线的测定结果来确定。 个人建议：（个人建议：（1）桨法和篮法均考查）桨法和篮法均考查50、75和和100rpm。（。（2）将溶出曲线测定放在溶）将溶出曲线测定放在溶出度测定方法验证之前进行。出度测定方法验证之前进行。总结及个人观点总结及个人观点现场考核中的几个问题：现场考核中的几个问题：1. 资料中溶液配比
25、资料中溶液配比80：20应改为比号应改为比号80 : 20 。2. 线性试验中含量或有关物质浓度的溶液线性试验中含量或有关物质浓度的溶液应设应设计在线性的中间点上计在线性的中间点上。 3. 需对需对溶出介质体积的选择溶出介质体积的选择进行考察进行考察4. 精密度精密度试验做的不够全面试验做的不够全面 5. 经咨询审评中心李超科长获知，湖南省经咨询审评中心李超科长获知，湖南省局审评科会对申报资料中的局审评科会对申报资料中的附图附图全部看一遍，全部看一遍，发现有问题的将不通过检查，近二个月以来已发现有问题的将不通过检查，近二个月以来已有两家因为有两家因为图谱有造假情况而未通过检查图谱有造假情况而未通过检查，且，且要求问题企业就此事向省局做全面汇报。要求问题企业就此事向省局做全面汇报。 现场考核中的几个问题现场考核中的几个问题