2022年微生物的实验 .pdf

《2022年微生物的实验 .pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2022年微生物的实验 .pdf（5页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、实验一油镜的使用方法与革兰氏染色实验目的 :掌握油镜的使用方法与革兰氏染色的方法实验原理 : 革兰染色法 革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，脂质含量多，乙醇易透入。 革兰阳性菌等电点（pI 23）比革兰阴性菌（pI 45）低，在相同pH 条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合较牢固，不易脱色。革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、 结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。实验步骤 : 1.涂片取洁净载玻片1 张，用接种环取1 2环生理盐水放于

2、载玻片上，用灭菌的接种环在固体培养基上挑取少许细菌与盐水混合，涂布成直径cm 左右的菌膜（可视挑取菌落的多少涂片范围相应变化）。若采用液体培养物，可直接取12环菌液涂布。 接种环须经火焰灭菌方可放回原处，以免造成污染。2.干燥涂片最好在室温中自然干燥，或将标本接种面向上，置酒精灯火焰高处慢慢烘干，切勿在火焰上烤。3.固定干燥后的标本面向上迅速通过火焰3 次，这样既可杀菌，又能将细菌固定在玻片上，以免玻片上细菌在染色过程中被水冲洗掉。2.染色(1)初染：滴加结晶紫染液23 滴于涂布细菌处，覆盖菌膜，1min 后以细水漫过轻洗，将积水甩干。(2)媒染：滴加卢戈碘液同上，1min 后水洗，并将标本片

3、上的积水甩净。(3)脱色：加95%乙醇数滴于标本片上，轻轻摇晃数秒，斜持玻片使乙醇流掉，再滴加乙醇直至无紫色脱下为止（约30s，灵活掌握时间） ，细水冲洗，甩干。(4)复染：滴加石炭酸复红染液，30s1min 后水洗，用吸水纸吸去积水。3. 镜检用油镜观察，并判断细菌的染色性。记录实验结果。4.实验后处理擦干油镜镜头，整理、清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放入消毒缸中。注意事项 : 1.标本片涂的太薄或太厚，菌体分散布不均匀，都可影响染色结果。2.染液因素，所有染液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脱色用的乙醇以95浓度为宜，若染瓶密封不严或涂片积水

4、过多，可使乙醇浓度降低而增强脱色能力。3.选用培养1218h 菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡常使革兰阳性菌呈阴性反应。思考题 : 革兰染色成败的关键在于什么？实验二培养基的制备与细菌的生化反应实验目的 : 掌握培养基的制备与细菌生化反应的操作方法实验原理 : （一）靛基质（吲哚Indole）试验有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸生成靛基质（吲哚）。吲哚本身无色，不易直接观察，此时加入对二甲基氨基苯甲醛（吲哚试剂），则可相互作用而生成红色的玫瑰吲哚，肉眼即可观察。（二）甲基红（Methyl red,MR ）试验名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - -

5、 - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 5 页 - - - - - - - - - 甲基红是一种指示剂（变色范围为pH4.4（红色） 6.2（黄色），可测定细菌分解葡萄糖后培养基中最终的酸碱度，用以鉴别肠道杆菌。细菌（如大肠杆菌）分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 值降至 4.5 以下，加入甲基红指示剂呈红色，为阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少或产生的丙酮酸进一步转化为醇、酮、醛、水等，则培养基的pH 值在 6.2 以上，加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应，如产气杆菌。（三）糖发酵试验细

6、菌含有发酵不同糖类的酶，有些能分解糖 （醇）产酸， 使指示剂变色； 有些能产酸又产气。糖发酵管是将葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇或蔗糖等加入蛋白胨水培养基内，使其最终浓度 0.75%-1%， 并加入一定量的溴甲酚紫指示剂，制成微量发酵管。 接种细菌经37孵育后，产酸则使指示剂变为黄色、如有气体形成，在微量管内形成气柱。实验步骤 : 1.培养基制备的基本过程包括条调配成分、溶解、矫正pH、过滤澄清、分装、灭菌、质量检查和保存。 调配成分：按培养基组成准确称取各成分用量，放入锥形瓶或大容量烧瓶中，加一定量蒸馏水，使其充分混合。应注意染料、胆盐和指示剂等应在矫正pH 后加入。 溶解：将调配好的混合物在

7、沸水浴或流动蒸汽灭菌器中，使其完全溶解。不可将培养基装在铜铁容器中加热，因培养基中铜含量超过0.3mg/L 时，细菌不易生长；含铁量超过0.14mg/L 时可抑制细菌毒素的产生。 矫正 pH：一般将培养基的pH 调至 7.2 7.6 左右。经高压灭菌后其pH 可发生 0.10.2变动。若用NaOH 矫正，高压灭菌后pH 下降 0.10.2；若用 NaCO3 矫正，高压灭菌后pH升高 0.10.2。 滤过澄清：自配的培养基通常有一些浑浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。液体或半固体培养基常用滤纸过滤，固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。 分装：基础培养基：一般分装于锥形瓶灭菌后备用，

8、以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；琼脂斜面：通常在熔化后分装于试管，量约为试管高度的1/41/3，加热后灭菌，趁热摆成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3，且保持试管下端有1cm 柱高；半固体培养基：分装量为试管容量的1/41/3，加塞灭菌后趁热直立凝固；琼脂高层培养基：分装量为试管长的2/3（接种厌氧菌用） ，灭菌后趁热直立凝固；琼脂平板无菌分注：先将灭菌琼脂熔化后冷却至50 C 左右， 以无菌操作倾注于灭菌平皿内（内径 90mm 的平皿约 1315 ml） ，水平旋转平皿，待琼脂凝固后将平皿翻转，置4 C 保存备用。 灭菌：由耐热物质配制成的培养基（如普通营养琼脂等）常用高压蒸气灭菌，

9、条件为103.43kPa,1520min;含糖培养基以68.95 kPa,1015min 为宜，以免破坏糖类物质。不耐高热的物质配制成的培养基，如糖类、明胶和牛乳等常用流通蒸气灭菌，方法是加温80100 C30 min，每天一次，连续3 天。富含蛋白质的培养基（如含血清）需将基础培养基先行灭菌，再将血清过滤除菌后混装。 质量检测： 需做无菌试验和效果试验。无菌试验： 将灭菌后的培养基置35 C 孵育 24h,无任何细菌生长为合格；效果试验： 将已知的标准菌株接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。保存：制备好的培养基应注明名称、制作日期，存放于4 C 冰箱。

10、（一）靛基质（吲哚Indole）试验分别接种大肠杆菌、变形杆菌于2 支蛋白胨水培养基中。37孵育 48h后取出， 每管分别沿管壁缓缓加入吲哚试剂23 滴于液面上， 静置数分钟， 在两液接触面呈玫瑰色（环状） 者为阳性，以 “ ” 表示。反之，则为阴性。名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 5 页 - - - - - - - - - （二）甲基红（Methyl red,MR ）试验1. 分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2 支葡萄糖蛋白胨水培养基中。2. 37培养 23

11、d 后取出，分别滴加甲基红指示剂23 滴，可立即观察。红色者为阳性，黄色者阴性。（三）糖发酵试验1.将大肠杆菌、 伤寒杆菌分别按液体培养基接种法接种于支葡萄糖发酵管和2 支乳糖发酵管， 37孵育 18-24h 后取出观察。2.观察结果时，若细菌分解糖类产酸，则使指示剂变色为黄色，可用符号“ ” 表示；若分解糖类产酸又产生气体，微量发酵管中集有气柱，用符号 “ ” 表示；若不能分解糖类，指示剂不变色，可用符号“ ” 表示。思考题：生化反应有何实际用途？实验三外界因素对细菌的影响实验目的：掌握常用的消毒灭菌的方法实验原理：高温使细菌蛋白质变性导致细菌死亡，紫外线可破坏细菌DNA 实验步骤：（一）高

12、压灭菌法对细菌的影响将大肠杆菌与枯草杆菌分别接种于肉汤培养基内，经高压灭菌后取出，37培养 24 小时，记录现象并分析原因。（二）紫外线对细菌的影响1.以接种环取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别在琼脂平板上作密集线接种，使细菌能均匀分布于平板表面。2.除去平皿盖，代之以黑纸片，置于紫外线灯下（距离20-30cm）照射 1 小时。3. 盖上皿盖， 37培养 24 小时，观察细菌生长情况。（三）常用化学消毒剂的杀菌实验各种化学消毒剂的作用机制不一，而且杀灭细菌的效果也有差别，本实验主要证明不同消毒剂的不同浓度对不同的细菌的作用。1 分别用无菌棉签沾取葡萄球菌和大肠肝菌菌液，密涂于2 个普通平板表面。2

13、 用镊子夹取无菌滤片各2 张，分别浸于石炭酸、来苏儿、 碘酒、龙胆紫及过氧乙消毒剂内。取出时，将纸片在试管壁上滑行，去除多余的药液，分别贴在已涂有细菌的平板表面，使纸片之间间隔一定距离，并大致辞相等。3 各平板和纸片在平皿上作好标记，放 37卵育 24h，观察纸片周围有无抑菌圈并比较其大小（四）药敏实验1用无菌棉签分别沾取葡萄球菌、痢疾杆菌菌液涂布于2 只 MH 琼脂平板。2分别用镊子夹取各种抗生素药物滤纸片，贴在每一只平板琼脂表面，每张纸片间距不少于 24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm，并作好标记。337培养 1824 小时后， 观察有无抑菌环及其大小。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明

14、显生长为限。分别测量各纸片抑菌环直径（mm） ，判定其敏感度。思考题：药敏实验有何实际用途？实验四细菌分布与抗生素的MIC 测定名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 5 页 - - - - - - - - - 实验目的 : 掌握抗生素的MIC 测定方法，了解细菌的分布情况实验原理 : 抗生素顺浓度梯度递减使细菌生长，观察最小抑菌浓度为该抗生素的MIC. 一、实验步骤：细菌的分布1. 口腔细菌检查取 10绵羊 RBC 琼脂平板深咳，置37孵育箱， 24h 观察菌落

15、生长情况并计数。2. 空气细菌检查取普通琼脂平板置打开盖，置桌面上，空气中细菌自然落入，30 分钟后置 37孵育箱， 24h 观察菌落生长情况并计数。3. 手指细菌检查食指在培养基上轻轻按一下，置37孵育箱， 24h 观察菌落生长情况并计数。MIC 测定1. 取小试管 7 支并编号2. 用无菌吸管在每支试管中加培养基1ml 3. 另取 1 支无菌吸管吸取抗生素（庆大霉素5IU/ml ）加入第一管中混匀，吸取1ml 加入第二管中混匀，依次类推，第六管吸取1ml 弃去，第七管不加作为阳性对照。4. 每管加入菌液0.1ml 5. 置 37孵育箱24h 观察，生长管的前一管为该抗生素的MIC 思考题：

16、 MIC 实验有何实际用途？实验五口服药品的微生物检查和无菌针剂的无菌检查实验目的 : 掌握口服药品的微生物检查和无菌针剂的无菌检查方法实验原理 : 口服药品通过不同倍数的稀释，取样倾注培养基中，培养计数。针剂药品中微生物各种培养基（需氧、厌氧、霉菌）的培养观察生长情况。实验步骤：一、口服药品的微生物检查1. 取待检样品10g 乳钵研碎，加无菌生理盐水10ml（1g/1ml） ，视样品污染程度稀释呈不同浓度，各取1ml 加到无菌平板中，然后倾注15ml 已溶化的营养琼脂混匀，冷却凝固后置37孵育箱2. 24h 培养进行菌落计数。二、针剂的无菌检查1. 取需氧培养基、厌氧培养基、霉菌培养基各一管

17、，分别加入无菌针剂样品01ml， 霉菌置 2528孵育箱， 24h 观察一次， 连续观察一周看有无霉菌生长，一周后无菌生长，可报阴性（或未发现霉菌生长）其他细菌置37孵育箱培养24h 后观察有无细菌生长。思考题：口服药品和针剂样品的检查方法有什么不同实验六抗生素的效价测定（二剂量法）实验目的 : 掌握抗生素的效价测定的方法实验原理 : 将制备好的并混有细菌的高层琼脂并放置小钢管，分别把标准品的高浓度溶液、标准品的低浓度溶液、待检品高浓度溶液和待检品低浓度溶液加入小钢管中，置481824h，取出后量取抑菌环直径，求V、W 值，以V 值为横坐标，W 值为竖坐标查放线图，名师资料总结 - - -精品

18、资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 5 页 - - - - - - - - - 求取待检抗生素的效价值。实验步骤： 1. 制备琼脂底层。2. 取短小芽胞杆菌菌液0.2ml 加入溶化的琼脂内，并迅速倾入已制好的底层上面待凝固后放入四个小钢管。 。3. 分别再小钢管中加入标准品和待检品的抗生素，置371824h 观察结果。4. 取出量取抑菌环直径（mm）代入计算公式，求取V、W.值。5. 查放线图得出抗生素的效价思考题：抗生素效价的应用及意义名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 5 页 - - - - - - - - -