2022年免疫学检测 .pdf

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1、1 第十九章免疫学检测免疫学检测技术已在医学和生物学研究领域被广泛应用。在临床医学中，免疫学检测可用于探讨免疫相关疾病的发病机制及其诊断、病情监测与疗效评价等，也可用于评价实验动物的免疫功能状态。随着现代免疫学以及细胞生物学、分子生物学等相关学科的进展，免疫学检测技术也不断发展和更新，新方法层出不穷。本章仅介绍免疫学常用检测技术的基本原理及其临床应用。第一节抗原抗体结合反应的特点及影响因素一、抗原抗体反应的特点（一）特异性一种抗原一般仅能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原-抗体结合反应的专一性即特异性。抗原与抗体发生结合反应的物质基础是：抗原决定簇与抗体的抗原结合部位间存在结构的互补性，二者

2、相互结合，在适宜条件下，出现可见反应。二者的空间构型互补程度不同，结合力强弱也各异，互补程度越高，结合能力越强。用已知抗原免疫人或动物后，机体血清中会出现特异性抗体，这种抗体称为第一抗体（简称一抗）。由于Ig 有同种型抗原特异性，将人Ig 免疫动物，或将动物 Ig 免疫异种动物， 均可产生抗抗体， 又称第二抗体 （简称二抗）。用上述免疫接种方法制备的血清习惯上称为抗血清(antiserum) ，后者在免疫学检测中被广泛应用。例如，用某种细菌免疫家兔制备抗血清，其中含有一抗；将兔血清Ig 免疫绵羊可制备出羊抗兔Ig 血清，即二抗。在检测某种细菌时，可单独使用一抗，使之与该细菌特异性结合；也可在使

3、用一抗后再加用二抗，通过二抗与一抗特异性结合，进而检测一抗所识别的细菌。（二）可见性天然抗原分子表面一般含多种抗原决定簇，也可含多个同一抗原决定簇，从而可提供多个抗体分子结合的部位，故为多价。若抗体分子是单体 Ig，仅有两个 Fab段，其能结合两个相同的抗原决定簇，是为两价。在抗原 -抗体反应中，若不考虑抗原、抗体的数量比例，则很可能出现抗名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 1 页，共 12 页 - - - - - - - - - 2 原或抗体过剩。由于过剩一方的结合价不

4、能被完全占据，多呈游离形式存在，故仅形成小分子复合物，不能被肉眼察见，亦难以判定结果。若抗原、抗体的数量比例恰当，抗体分子的两个Fab 段分别与两个抗原分子结合，相互交叉连接成网格状复合体，反应体系中基本无游离的抗原或抗体。此时，可形成肉眼可见的明显反应物（沉淀物或凝集物）。因此，确定抗原、抗体的最适比例十分重要，应根据抗原的物理性状，对抗原或抗体进行稀释，以确定最适比例。（三）可逆性抗原与抗体的结合为分子表面的非共价结合，结合稳定且可逆。在一定条件下，抗原抗体结合形成的复合物可被解离，如低pH、高浓度盐、冻融等。解离后的抗原或抗体分子仍保持原有的理化特性和生物学活性。如解离后的外毒素恢复其毒

5、性，细菌仍可存活。二、影响抗原抗体反应的其它因素抗原 -抗体结合过程可分为两个阶段：第一阶段为特异性结合阶段，此阶段反应迅速，在数秒钟至数分钟内完成，但无可见反应；第二阶段为可见反应阶段，历时数分钟至数小时，此阶段易受以下因素影响：（一）电解质抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应。故免疫学试验中多采用生理盐水稀释抗原或抗体。（二）酸碱度最适 pH 是 68。超出此范围可影响抗原、抗体的理化性状，出现假阳性或假阴性。（三）温度适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会，加快二者结合的速度。抗体抗原反应的最适温度为37

6、0C。此外，适当震荡或搅拌也可促进抗原-抗体分子的接触，提高结合速度。第二节抗原-抗体反应的基本检测方法名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 2 页，共 12 页 - - - - - - - - - 3 根据抗原的性质、 结合反应的现象、 参与反应的成分因素， 可将抗原抗体反应分为凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应、采用标记物的抗原抗体反应等。一、 凝集反应细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块，此类反应称为凝集反应 (agglutination) 。1. 直

7、接凝集将细菌或红细胞与相应抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。一种方法是用已知抗体与相应抗原在玻片上反应，用于抗原的定性检测，如ABO 血型鉴定、细菌鉴定。另一种方法是在试管中连续稀释待检血清，加入已知颗粒性抗原，用于抗体的定量检测，如诊断伤寒病的肥达试验。2. 间接凝集将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体反应，出现颗粒物凝集的现象。常用的载体为人O 型血红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒等。例如，用球蛋白包被的乳胶颗粒检测病人血清中的一种抗人球蛋白抗体（即类风湿因子）。也可用已知抗体包被乳胶颗粒，检测标本中的相应抗原。 此外， 抗球蛋白试验 (antiglobulin te

8、st), 又称库姆斯试验（Coombs test)，也属间接凝集。借助该法检查血清中抗Rh 抗体（IgG）用于诊断免疫性溶血性贫血，其原理是： 抗 Rh抗体与 Rh+红细胞结合后很难直接引起红细胞凝集，但加入抗人IgG 抗体后，通过二抗把一抗和红细胞的复合物相连接，从而出现可见的红细胞凝集现象。二、沉淀反应血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，此类反应称为沉淀反应(precipitation)。沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散。即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇时形成可见的白色沉淀。1. 单向免疫扩散 (single im

9、munodiffusion) 将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量呈正相关。取已知量抗原绘制标准曲线，可根据所形成沉淀环的直径，从标准曲线中查出待检标本的抗原含量。本法常用于名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 3 页，共 12 页 - - - - - - - - - 4 定量测定血清IgG、IgM、IgA 和 C3等。2. 双向免疫扩散(double

10、 immunodiffusion) 将抗原与抗体分别加于琼脂凝胶的小孔中，二者自由向四周扩散，在相遇处形成沉淀线。若反应体系中含两种以上抗原-抗体系统，则小孔间可出现两条以上沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原的相关性分析。3. 免疫电泳 (immunoelectrophoresis) 先将待检血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组份被分为不同区带，然后按电泳方向平行挖一小槽，加入相应抗血清，与已分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应位置形成沉淀弧。对照正常血清形成的沉淀弧数量、位置和形态，可分析标本中所含抗原成分的性质和含量。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察I

11、g 异常增多或缺失，可诊断骨髓瘤及性联低丙种球蛋白血症等疾病。4. 免疫比浊 (immunonephelometry) 在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成免疫复合物，液体混浊。用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多则浊度越高，可绘制标准曲线并依据反应液体的浊度推算样品中抗原含量。该法快速简便，可取代单向免疫扩散用于测定 Ig 含量。三、补体参与的反应应用抗体与红细胞表面的抗原结合，激活反应体系中的补体成份，能导致红细胞溶解，则可根据溶血现象判定试验结果。补体结合试验和溶血空斑试验（后叙）均属此类反应。补体结合试验曾用于检测多种细菌、病毒的抗原或抗体，因易受多种试验条件影响，

12、已渐被其它方法取代。此外，补体依赖的微量细胞毒实验曾用于HLA 的血清学分型，方法是：将标准分型血清与待检淋巴细胞反应，再加入兔补体，若细胞表面表达相应 HLA 抗原，则被溶解。溶解细胞可被台盼蓝或伊红染料着色，而活细胞不着色，借此判定结果。四、用标记抗体或抗原进行的抗原-抗体反应免疫标记技术乃用荧光素、酶或放射性核素等标记抗体或抗原，进行抗原 -抗体反应，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与抗体名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 4 页，共 12 页 - - -

13、 - - - - - - 5 或抗原连接后并不改变后者的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。1. 免疫荧光法 (immunofluorescence, IF) 此法乃用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原-抗体复合物散发荧光，借此鉴定或定位标本中的抗原。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(FITC) 和藻红蛋白（ PE），前者发黄绿色荧光，后者发红色荧光。（1） 直接荧光法：将荧光素直接标记抗体， 对标本进行染色（图 19-1） 。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。（2）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用荧光

14、素标记的二抗染色（图19-1）。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检查，但非特异性反应亦增加。免疫荧光法可用于检查细菌、病毒、螺旋体等抗原或抗体， 用于诊断传染病，还可用于鉴定免疫细胞表面的CD 分子，检测自身免疫病的抗核抗体等。图 19-1 免疫荧光法2. 酶免疫测定 (enzyme immunoassay, EIA) 此法将抗原 -抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。可用目测定性，也可用酶标测定仪测定光密度（OD）值以反映抗原含量， 灵敏度可达每毫升ng甚至 pg水平。常用于标记的酶有辣根 过 氧 化 物 酶

15、 (horseradish peroxidase, HRP) 、 碱 性 磷 酸 酶 (alkaline phosphatase, AP)等。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者检测组织或细胞表面抗原。酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 是酶免疫测定中应用最广的技术。其基本方法是：将已知抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原-抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将固相上的抗原-抗体复合物与液相中的游离成份分开。ELISA的操作方法很多，以下简介几种基本方法。（1）双抗体夹心

16、法：用于检查特异性抗原。将已知抗体包被固相，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入该抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 5 页，共 12 页 - - - - - - - - - 6 抗体，加底物后显色（图19-2）。若标本中无相应抗原，固相表面即无抗原结合，加入的酶标记抗体则不能结合于固相并被洗涤去除，当加入无色底物后，因无酶催化故不显色。（2）间接法：用于检查特异性抗体。用已知抗原包被固

17、相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应（图19-2）。图 19-2 酶联免疫吸附试验（3）BAS-ELISA ：生物素 (biotin)是广泛分布于动植物体内的一种生长因子，又称辅酶R 或维生素 H。亲和素 (avidin)是卵白及某些微生物中的一种蛋白质，由四个亚单位组成。二者有高度亲和力，且均能偶联抗体、抗原和辣根过氧化物酶而不影响其生物学活性。在生物素-亲和素系统(biotin avidin system, BAS)中，借助所形成的亲和素-生物素 -酶复合物，追踪生物素标记的抗原或抗体，通过酶催化底物显色，可检出相应的抗体或抗原。由于抗原或抗体分子可偶联多个生物素，且

18、 1 个亲和素分子可结合 4 个生物素分子，组成新的生物放大系统，进一步提高检测的灵敏度。例如：用此法检查标本中的特异性抗原时，先用已知抗体包被固相，依次加入待检样品、生物素标记的特异抗体、亲和素及酶标记的生物素，最后加底物显色。生物素也可结合核苷酸，故BAS 除用于抗原 -抗体检测外，还可用于检测DNA 和 RNA。ELISA 敏感性高、操作简便，配套仪器设备的发展使操作程序规范化和自动化，并进一步提高了稳定性，被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其它体液中微量蛋白成分、细胞因子等。免疫组化技术 (immunohitochemistry techenique) 是应用标记的抗体与组织或

19、细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对抗原作定性、定量、定位检测。常用的技术包括酶免疫组化（辣根过氧化物酶标记）、免疫金组化（胶体金颗粒标记）、免疫电镜技术（铁蛋白、胶体金、过氧化物酶标记）等。3. 放射免疫测定法(radioimmunoassay, RIA) 乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。它将放射性核素具有的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性相结合，使检测的灵敏度达pg 水平。常用于标记的放射性核素有125I 和131I，采用的方法分为液相法和固相法两种。该法常用于测定微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - -

20、 - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 6 页，共 12 页 - - - - - - - - - 7 地高辛等药物，以及IgE等。4. 化学发光免疫分析将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体进行反应，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下生成激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时发射出光子，用自动发光分析仪接收光信号，测定光子产量，以反映待检样品中抗体或抗原含量。该法灵敏度高于放射免疫测定法，常用于血清超微量活性物质的测定，如甲状腺素等激素。5. 免疫印迹法 (Wstern blot) 该法又称 Wstern 印迹

21、法。它将凝胶电泳与固相免疫结合，将通过电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再借助酶免疫、放射免疫等技术进行测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原。例如应用该法检测血清 HIV 抗体，可用于确认HIV 感染。其方法为：第一步，用离子去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）裂解 HIV 结构蛋白，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 将分子量不同的蛋白质分开， 这一方法简称 SDS-PAGE；第二步，将通过电泳而分离的病毒蛋白质转印至硝酸纤维膜上（电转印法）；第三步，将硝酸纤维膜浸于待检血清中，若血清含HIV 抗体，即与膜上的相应病毒蛋白抗原结合，洗涤去除未结合的抗体

22、，再加酶标记的二抗，最后加底物显色（图19-3）。图中结果表明，待检血清中有针对 HIV120kD、41kD和 24kD 蛋白的相应抗体。图 19-3 免疫印迹法检测HIV 抗体第三节淋巴细胞的测定检测淋巴细胞的类别、数量与功能，是判断机体免疫功能状态的重要手段。患者外周血是主要的标本来源，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾脏、淋巴节等作为标本进行检查。一、淋巴细胞的类别鉴定1. 外周血单个核细胞的分离体外检测淋巴细胞，首先需制备外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，常用的方法是葡聚糖 -泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液

23、）密度梯度离心法。该法所用的淋名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 7 页，共 12 页 - - - - - - - - - 8 巴细胞分离液比重为1.077 左右，红细胞和多形核白细胞的比重（1.092左右）大于PBMC（1.075左右）。将抗凝血叠加于分离液上，通过低速离心，即可将不同比重的细胞分层：红细胞沉于管底；多形核白细胞密集布于红细胞层与分离液之间；血小板悬浮于血浆中；PBMC 则密集于血浆层与分离液界面。该法分离淋巴细胞的纯度可达95%。若需进一步纯化淋巴细胞

24、，可将PBMC 铺于培养皿上，由于单核细胞易与玻璃粘附而滞留于平皿上，收集未吸附的细胞即为富含淋巴细胞的悬液。2. 淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞为不均一的群体，可分为表面标志及功能各异的群和亚群。用以下方法可分离、分选所需群体细胞。（1）尼龙棉分离法：将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B 细胞易粘附于尼龙棉而滞留于柱上，T 细胞则不粘附，借此可分离T 细胞与 B 细胞。（2） E花结分离法：人成熟 T细胞表面 CD2分子是绵羊红细胞（SRBC）受体，能结合 SRBC 而形成花结（ E花结试验）。方法为：作密度梯度离心，因花结形成细胞比重增大而沉于管底，与其它细胞分离；用低渗法裂解花结中的SRBC，即获

25、得纯化的T 细胞。（3）洗淘法：将已知抗细胞表面标记的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，表达相应表面标记的细胞即结合于培养板表面，与悬液中的其它细胞分开。例如，用抗CD3 抗体包被培养板，可将T 细胞与其它细胞分开；用抗CD4 抗体则可将T 细胞悬液中的CD4+ T 细胞与CD8+T 细胞分开。（4）流式细胞术 (flow cytometry，FCM)：乃借助荧光活化细胞分类仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS) 对细胞进行快速、准确鉴定和分类的技术。流式细胞仪集光学、流体力学、电子学和计算机技术于一体，可对细胞作多参数定量测定和综合分析。

26、样品经多种荧光素标记的抗体染色，因荧光素发射光谱的波长不同，信号能同时被接收，故能同时分析细胞表面多个分子的表达及其水平。该法可检测T 细胞、 B 细胞、 NK细胞、单核 /巨噬细胞、树突状细胞等及其比率，以及CD4/CD8 阳性 T 细胞比值等。此外，借助光电效应，微滴通过电场时出现不同偏向，从而可分类收集所需细胞。（5）磁分离技术：将特异性抗体与磁性微粒交联，称为免疫磁珠（immune magnetic bead,IMB）。IMB 可与表达相应膜抗原的细胞结合，应用强磁场分离IMB 及其所吸附的细胞，从而对特定的细胞进行分选，此珐为直接分离法。亦可用二抗包被磁性微珠，与任何已结合鼠源性一名

27、师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 8 页，共 12 页 - - - - - - - - - 9 抗的细胞进行反应，从而对细胞进行分离，此为间接分离法。二、淋巴细胞功能测定细胞免疫涉及多种免疫细胞间的相互作用和多种细胞因子的参与，功能测定的指标体系较复杂，且方法不易标准化。（一） T 细胞功能测定1. T 细胞增殖试验植物血凝素（ PHA）、刀豆蛋白 A（Con A）等丝裂原以及抗CD3 抗体等均能非特异性激活培养的T 细胞，使其转化为淋巴母细胞。在增殖过程中，细胞DNA、

28、RNA、蛋白质合成增加，细胞形态发生改变，最终细胞分裂。（1）3H-TdR 掺入法：在PBMC 中加入 PHA 共同培养，终止培养前815小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），由于3H-TdR 能掺入细胞合成的 DNA 中，故细胞增殖水平越高，掺入的放射性核素亦越多。培养结束后收集细胞，用液体闪烁仪测定样品的放射活性，可反映细胞的增殖状况。该法灵敏可靠，应用广泛，但需特殊仪器，易发生放射性污染。（2）MTT 法：MTT 是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基 -2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑。 在细胞培养终止前数小时加入MTT ，其作为细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物参与反应，形成

29、褐色甲臢颗粒并沉积于细胞内或细胞周围。甲臢可被随后加入的盐酸异丙醇或二甲基亚砜完全溶解，可用酶标测定仪测定细胞培养物OD 值。甲臢生成量与细胞增殖水平呈正相关，故样品OD 值可反映细胞增殖水平的高低。MTT 法的灵敏度虽不及3H-TdR 掺入法，但其操作简便，且无放射性污染，T 细胞增殖试验也可检测特异性抗原致敏的T 细胞。在培养细胞中加入特异性抗原，则只有该抗原特异的T 细胞发生增殖反应，从而反映机体的特异性细胞免疫功能。2. 细胞毒试验CTL、NK 细胞对靶细胞均有直接杀伤作用，可根据待检效应细胞的性质，选用相应的靶细胞，如肿瘤细胞、移植供体细胞等。该试验可用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒

30、感染等方面的研究。（1）51Cr 释放法：用 Na251CrO4 标记靶细胞，若待检效应细胞能杀伤靶细胞，则51Cr 从靶细胞内释出。以计数仪测定释出的51Cr 放射活性，靶细胞溶解破坏越多，51Cr 释放越多， 上清液的放射活性越高。应用公式名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 9 页，共 12 页 - - - - - - - - - 10 可计算出待检细胞的杀伤活性。（2）酶释放法：效 /靶细胞进行反应并离心，借助比色法测定靶细胞膜受损后从胞浆内所释放出的乳酸脱氢酶活性

31、，其水平反映效应细胞的杀伤活性。（3）凋亡细胞检查法：细胞毒性细胞介导靶细胞凋亡时，内源性核酸水解酶将靶细胞DNA 在核小体单位之间切断，产生180200bp（核小体单位长度）及其倍数的寡核苷酸片段， 在琼脂糖电泳中呈现阶梯状DNA区带图谱，借此可反映细胞凋亡。如需测定凋亡细胞数目及细胞类型，可 在 细 胞 培 养 物 中 加 入 末 端 脱 氧 核 苷 酸 转 移 酶 (terminal deoxyribonucleotidyl transferase, TdT)和生物素标记的核苷酸，TdT 能在游离的 DNA 3，端缺口连接上标记的核苷酸，利用亲和素-生物素 -酶放大系统，在 DNA 断裂

32、处显色，从而指示凋亡细胞。正常细胞无DNA 断裂，故不显色。将待检细胞和靶细胞按比例混合，培养一定时间后取培养物涂片，加入TdT 和其它试剂，光镜下检查计数凋亡细胞，反映待检细胞的杀伤活性。该法所用标记核苷酸多为dUTP，故称TUNEL 法(TdT dependent dUTP-biotin nick end labeling) 。4. 皮肤试验正常机体对特定抗原产生细胞免疫应答后，再用相同抗原作皮肤试验，即出现以局部红肿为特征的迟发型超敏反应，细胞免疫正常者呈阳性反应，而细胞免疫低下者则呈阴性反应。皮肤试验方法简便，可帮助诊断某些病原微生物感染（结核杆菌、麻风杆菌）、免疫缺陷病等。皮肤试验常

33、用的生物性抗原多从病原体中提取，如结核菌素、麻风菌素、链激酶-链道酶、念珠菌素、腮腺炎病毒等。(二) B 细胞功能测定检测 B 细胞数量和功能是确定体液免疫正常与否的重要方法。1. B 细胞增殖试验B 细胞受有丝分裂原刺激后分裂增殖，温育一定时间后检查抗体形成细胞的数目。小鼠B 细胞可用细菌脂多糖为刺激物，人 B 细胞则用含有金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）的金黄色葡萄球菌菌体及抗 IgM 抗体刺激。2. 抗体形成细胞测定常用溶血空斑试验 (hemolytic plaque assay) ，即测定针对SRBC 表面已知抗原的抗体形成细胞数目。其基本原理是：抗体形成细胞分泌的Ig 与 SRBC 表

34、面抗原结合，在补体参与下出现溶血反应。方法是将吸附有已知抗原的SRBC、待检的 B 细胞、补体及适量琼脂糖液混合， 倾注平皿，温育 13小时后，肉眼可见分散的溶血空斑，每名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 10 页，共 12 页 - - - - - - - - - 11 一空斑中央含一个抗体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数。第四节免疫分子的检测一、免疫球蛋白的测定免疫球蛋白的测定有两类方法。一类是在体外用已知抗原检测相应抗体，如多种感染性疾病的辅助诊断与流行病学调查，

35、前已述及；另一类是用已知抗体对各类免疫球蛋白作定性、定量测定。检测血清含量高的IgG、IgA、IgM 时，可用单向免疫扩散或免疫比浊法，而检测IgD、IgE则需选用 ELISA、 RIA 等灵敏度高的方法。 诊断免疫球蛋白异常性疾病 （如骨髓瘤、性联无丙种球蛋白血症等），可用免疫电泳等方法。二、补体测定血清补体含量与活性测定有助于了解体内补体激活状况，辅助有关疾病的诊断。对血清含量高的C3、C4、B 因子等，可用单向免疫扩散或免疫比浊法， 其它含量低的成分则用ELISA 、RIA 等方法。血清总补体活性测定常采用50%补体溶血法（CH50）其原理是：用 SRBC 和兔抗 SRBC作为抗原抗体复

36、合物， 通过经典途径激活待检血清中的补体，导致 SRBC溶解。若待检血清补体含量减少或成分缺失，则影响溶血结果，通常用50%溶血所需的最小补体量来计算总补体活性。三、细胞因子检测检测细胞因子主要用于了解其免疫调节作用；鉴定分离的淋巴细胞；监测某些疾病状态的细胞免疫功能。细胞因子检测方法包括以下三种。1. ELISA 用抗细胞因子抗体包被固相的双抗体夹心法，也可使用RIA 法。此法可用于检测IL-2、IL-5、IL-6 等。2. 生物活性测定法根据细胞因子生物学活性选用相应实验系统，包括细胞增殖法、直接杀伤法、保护细胞免受病毒致病变法等。如选用细胞因子依赖的细胞株，其增殖反应与细胞因子量呈正相关

37、，通过与相应标准品比较，可确定样品中细胞因子（如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6）含名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 11 页，共 12 页 - - - - - - - - - 12 量。3. 聚合酶链反应（ PCR）根据细胞因子的核苷酸序列，设计相应引物，借助逆转录PCR 测定待检细胞中特异性mRNA。该法可用于多种细胞因子的检定。四、CD 分子和粘附分子的检测检测细胞表面CD 分子和粘附分子可用于鉴别免疫细胞，并了解其分化、活化状况。 用已知的抗 CD 分子或

38、粘附分子抗体可鉴定细胞表面相应膜抗原，常用的方法有间接免疫荧光法、流式细胞术。五、HLA 分子的检测进行组织器官移植须作HLA 分型，过去多用血清学和细胞学分型，现已逐渐被基因分型技术取代。例如，聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）分型法，其原理是：应用针对某一HLA 座位各等位基因的序列特异性引物， 借助 PCR 特异性扩增待检细胞基因组DNA 的相应靶序列，根据 PCR 扩增产物的有无，确定相应等位基因的型别。该法具有快速、准确等优点。但是，由于HLA 分子的高度多态性，要确定同一等位基因中的各型别必须使用多个引物对。（朱道银）名师资料总结 - - -精品资料欢迎下载 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 名师精心整理 - - - - - - - 第 12 页，共 12 页 - - - - - - - - -