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1、-实验室操作规范本规程中列出了最基本的实验室操作和程序，他们是微生物学操作技术规范的基础。在规划实验室和国家级实验室项目时，可以根据这些规程来制订实验室安全操作的书面程序。每个实验室都应该采用“安全手册”或“操作手册”，其中定义了已知的和潜在的危害，并规定了特殊的操作程序来避免或尽量减小这种危害。规范的微生物学操作技术是实验室安全的基础，而专门的实验设备仅仅是一种补充，绝不能替代正确的操作规范。下面列出了一些最重要的概念。进入规定1、在处理危险度2 级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志（图1）。2、只有经批准的人员方可进入实验室工作区域。3、实验室的门应保
2、持关闭。4、儿童不应被批准或允许进入实验室工作区域。5、进入动物房应当经过特别批准。6、与实验室工作无关的动物不得带入实验室。人员防护1、在实验室工作时，任何时候都必须穿着连体衣、隔离服或工作服。2、在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性的材料或感染性动物的操作时，应戴上合适的手套。手套用完后，应先消毒再摘除，随后必须洗手。3、在处理完感染性实验材料和动物后，以及在离开实验室工作区域前，都必须洗手。4、为了防止眼睛或面部受到泼溅物、碰撞物或人工紫外线辐射的伤害，必须戴安全眼镜、面罩（面具）或其他防护设备。5、严禁穿着实验室防护服离开实验室，（如去餐厅、咖啡厅、办公室、图书馆
3、、员工休息室和卫生间）。6、不得在实验室内穿露脚趾的鞋子。7、禁止在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理隐形眼镜。8、禁止在实验室工作区域储存食品和饮料。9、在实验室内用过的防护服不得和日常服装放在同一柜子内。操作规范1、严禁用口吸移液管。2、严禁将实验材料置于口内。严禁舔标签。3、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。4、应限制使用皮下注射针头和注射器。除了进行肠道外注射或抽取实验动物体液，皮下注射针头和注射器不能用于替代移液管或用作其他用途。5、出现溢出、事故以及明显或可能暴露于感染性物质时，必须向实验室主管报告。实验室应保存这些事件或事故的书面报告。6、必须制
4、订关于如何处理溢出物的书面操作程序，并予以遵守执行。7、污染的液体在排放到生活污水管道以前必须清除污染（采用化学或物理学方法）。根据所处理的微生物因子的危险度评估结果，可能需要准备污水处理系统。8、需要带出实验室的手写文件必须保证在实验室内没有受到污染。实验室中标本的安全操作实验室标本的收集、运输和处理不当，会带来使相关人员感染的危险。标本容器标本容器可以是玻璃的，但最好使用塑料制品。标本容器应当坚固，正确地用盖子或塞子盖好后应无泄漏。在容器外部不能有残留物。容器上应当正确地粘贴标签以便于识别。标本的要求或说明书不能够卷在容器外面，而是要分开放置，最好放置在防水的袋子里。标本在设施内的传递为了
5、避免意外泄漏或溢出，应当使用盒子等二级容器，并将其固定在架子上使装有标本的容器保持直立。二级容器可以是金属或塑料制品，应该可以耐高压灭菌或耐受化学消毒剂的作用。密封口最好有一个垫圈，要定期清除污染。标本接收需要接收大量标本的实验室应当安排专门的房间或空间。打开包装接收和打开标本的人员应当了解标本对身体健康的潜在危害，并接受过如何采用标准防护方法3的培训，尤其是处理破碎或泄漏的容器时更应如此。标本的内层容器要在生物安全柜内打开，并准备好消毒剂。移液管和移液辅助器的使用1、应使用移液辅助器，严禁用口吸取。2、所有移液管应带有棉塞以减少移液器具的污染。3、不能向含有感染性物质的溶液中吹入气体。4、感
6、染性物质不能使用移液管反复吹吸混合。5、不能将液体从移液管内用力吹出。6、刻度对应（Mark-to-mark）移液管不需要排出最后一滴液体，因此最好使用这种移液管。7、污染的移液管应该完全浸泡在盛有适当消毒液的防碎容器中。移液管应当在消毒剂中浸泡适当时间后再进行处理。8、盛放废弃移液管的容器不能放在外面，应当放在生物安全柜内。9、有固定皮下注射针头的注射器不能够用于移液。10、在打开隔膜封口的瓶子时，应使用可以使用移液管的工具，而避免使用皮下注射针头和注射器。11、为了避免感染性物质从移液管中滴出而扩散，在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸，使用后将其按感染性废弃物处理。避免感
7、染性物质的扩散1、为了避免被接种物洒落，微生物接种环的直径应为23mm 并完全封闭，柄的长度应小于6cm 以减小抖动。2、使用封闭式微型电加热器消毒接种环，能够避免在本生灯的明火上加热所引起的感染性物质爆溅。最好使用不需要再进行消毒的一次性接种环。3、干燥痰液标本时要注意避免生成气溶胶。4、准备高压灭菌和或将被处理的废弃标本和培养物应当放置在防漏的容器内（如实验室废弃物袋）。在丢弃到废弃物盛器中以前，顶部要固定好（如采用高压灭菌胶带）。5、在每一阶段工作结束后，必须采用适当的消毒剂清除工作区的污染。详细资料见参考文献12。生物安全柜的使用1、应参考国家标准和相关文献，对所有可能的使用者都介绍生
8、物安全柜的使用方法和局限性（参见第10 章）。应当发给工作人员书面的规章、安全手册或操作手册。特别需要明确的是，当出现溢出破损或不良操作时，安全柜就不再能保护操作者。2、生物安全柜运行正常时才能使用。3、生物安全柜在使用中不能打开玻璃观察挡板。4、安全柜内应尽量少放置器材或标本，不能影响后部压力排风系统的气流循环。5、安全柜内不能使用本生灯，否则燃烧产生的热量会干扰气流并可能损坏过滤器。允许使用微型电加热器，但最好使用一次性无菌接种环。6、所有工作必须在工作台面的中后部进行，并能够通过玻璃观察挡板看到。7、尽量减少操作者身后的人员活动。8、操作者不应反复移出和伸进手臂以免干扰气流。9、不要使实
9、验记录本移液管以及其他物品阻挡空气格栅，因为这将干扰气体流动，引起物品的潜在污染和操作者的暴露。10、工作完成后以及每天下班前，应使用适当的消毒剂对生物安全柜的表面进行擦拭。11、在安全柜内的工作开始前和结束后，安全柜的风机应至少运行5min。12、在生物安全柜内操作时，不能进行文字工作。避免感染性物质的食入以及与皮肤和眼睛的接触1、微生物操作中释放的较大粒子和液滴（直径大于5m）会迅速沉降到工作台面和操作者的手上。实验室人员在操作时应戴一次性手套，并避免触摸口、眼及面部。2、不能在实验室内饮食和储存食品。3、在实验室里时，嘴里不应有东西钢笔、铅笔、口香糖。4、不应在实验室化妆。5、在所有可能
10、产生潜在感染性物质喷溅的操作过程中，操作人员应将面部、口和眼遮住或采取其他防护措施。避免感染性物质的注入1、通过认真练习和仔细操作，可以避免破损玻璃器皿的刺伤所引起的接种感染。应尽可能用塑料制品代替玻璃制品。2、锐器损伤（如通过皮下注射针头、巴斯德玻璃吸管以及破碎的玻璃）可能引起意外注入感染性物质。3、以下两点可以减少针刺损伤：（a）减少使用注射器和针头（可用一些简单的工具来打开瓶塞，然后使用吸管取样而不用注射器和针头）；（b）在必须使用注射器和针头时，采用锐器安全装置。4、不要重新给用过的注射器针头戴护套。一次性物品应丢弃在防耐穿透的带盖容器中。5、应当用巴斯德塑料吸管代替玻璃吸管。冰箱与冰
11、柜的维护和使用1、冰箱、低温冰箱和干冰柜应当定期除霜和清洁，应清理出所有在储存过程中破碎的安瓿和试管等物品。清理时应戴厚橡胶手套并进行面部防护，清理后要对内表面进行消毒。2、储存在冰箱内的所有容器应当清楚地标明内装物品的科学名称、储存日期和储存者的姓名。未标明的或废旧物品应当高压灭菌并丢弃。3、应当保存一份冻存物品的清单。4、除非有防爆措施，否则冰箱内不能放置易燃溶液。冰箱门上应注明这一点。装有冻干感染性物质安瓿的开启应该小心打开装有冻干物的安瓿，因为其内部可能处于负压，突然冲入的空气可能使一些物质扩散进入空气。安瓿应该在生物安全柜内打开，建议按下列步骤打开安瓿：1、首先清除安瓿外表面的污染。
12、2、如果管内有棉花或纤维塞，可以在管上靠近棉花或纤维塞的中部锉一痕迹。3、用一团酒精浸泡的棉花将安瓿包起来以保护双手，然后手持安瓿从标记的锉痕处打开。4、将顶部小心移去并按污染材料处理。5、如果塞子仍然在安瓿上，用消毒镊子除去。6、缓慢向安瓿中加入液体来重悬冻干物，避免出现泡沫。装有感染性物质安瓿的储存装有感染性物质的安瓿不能浸入液氮中，因为这样会造成有裂痕或密封不严的安瓿在取出时破碎或爆炸。如果需要低温保存，安瓿应当储存在液氮上面的气相中。此外，感染性物质应储存在低温冰箱或干冰中。当从冷藏处取出安瓿时，实验室工作人员应当进行眼睛和手的防护。以这种方式储存的安瓿在取出时应对外表面进行消毒。对血
13、液和其他体液、组织及排泄物的标准防护方法设计标准防护方法（其中包括“常规预防措施19”）以降低从已知或未知感染源的微生物传播危险2。标本的收集、标记和运输1、始终遵循标准防护方法2；所有操作均要戴手套。2、应当由受过培训的人员来采集病人或动物的血样。3、在静脉抽血时，应当使用一次性的安全真空采血管取代传统的针头和注射器，因为这样可以使血液直接采集到带塞的运输管和或培养管中。用完后自动废弃针头。4、装有标本的试管应置于适当容器中运至实验室（运输要求见第15 章），在实验室内部转运也应这样（见本章关于“在设施内转移标本”部分）。检验申请单应当分开放置在防水袋或信封内。5、接收人员不应打开这些袋子。
14、打开标本管和取样1、应当在生物安全柜内打开标本管。2、必须戴手套，并建议对眼睛和黏膜进行保护（护目镜或面罩）。3、在防护衣外面要再穿上塑料围裙。4、打开标本管时，应用纸或纱布抓住塞子以防止喷溅。玻璃器皿和“锐器”1、尽可能用塑料制品代替玻璃制品。只能用实验室级别（硼硅酸盐）的玻璃，任何破碎或有裂痕的玻璃制品均应丢弃。2、不能将皮下注射针作为移液管使用（参见本章“避免感染性物质的接种”部分）。用于显微镜观察的盖玻片和涂片用于显微镜观察的血液、唾液和粪便标本在固定和染色时，不必杀死涂片上的所有微生物和病毒。应当用镊子拿取这些东西，妥善储存，并经清除污染和或高压灭菌后再丢弃。微生物实验室应急程序刺伤
15、、切割伤或擦伤受伤人员应当脱下防护服，清洗双手和受伤部位，使用适当的皮肤消毒剂，必要时进行医学处理。要记录受伤原因和相关的微生物，并应保留完整适当的医疗记录。潜在感染性物质的食入应脱下受害人的防护服并进行医学处理。要报告食入材料的鉴定和事故发生的细节，并保留完整适当的医疗记录。潜在危害性气溶胶的释放（在生物安全柜以外）所有人员必须立即撤离相关区域，任何暴露人员都应接受医学咨询。应当立即通知实验室负责人和生物安全官员。为了使气溶胶排出和使较大的粒子沉降，在一定时间内（例如1 h 内）严禁人员入内。如果实验室没有中央通风系统，则应推迟进入实验室（例如24 h）。应张贴“禁止进入”的标志。过了相应时
16、间后，在生物安全官员的指导下来清除污染。应穿戴适当的防护服和呼吸保护装备。容器破碎及感染性物质的溢出应当立即用布或纸巾覆盖受感染性物质污染或受感染性物质溢洒的破碎物品。然后在上面倒上消毒剂，并使其作用适当时间。然后将布、纸巾以及破碎物品清理掉；玻璃碎片应用镊子清理。然后再用消毒剂擦拭污染区域。如果用簸箕清理破碎物，应当对他们进行高压灭菌或放在有效的消毒液内浸泡。用于清理的布、纸巾和抹布等应当放在盛放污染性废弃物的容器内。在所有这些操作过程中都应戴手套。如果实验表格或其他打印或手写材料被污染，应将这些信息复制，并将原件置于盛放污染性废弃物的容器内。未装可封闭离心桶的离心机内盛有潜在感染性物质的离
17、心管发生破裂如果机器正在运行时发生破裂或怀疑发生破裂，应关闭机器电源，让机器密闭（例如30min）使气溶胶沉积。如果机器停止后发现破裂，应立即将盖子盖上，并密闭（例如30min）。发生这两种情况时都应通知生物安全官员。随后的所有操作都应戴结实的手套（如厚橡胶手套），必要时可在外面戴适当的一次性手套。当清理玻璃碎片时应当使用镊子，或用镊子夹着的棉花来进行。所有破碎的离心管、玻璃碎片、离心桶、十字轴和转子都应放在无腐蚀性的、已知对相关微生物具有杀灭活性的消毒剂内（见第14 章）。未破损的带盖离心管应放在另一个有消毒剂的容器中，然后回收。离心机内腔应用适当浓度的同种消毒剂擦拭，并再次擦拭，然后用水冲
18、洗并干燥。清理时所使用的全部材料都应按感染性废弃物处理。急救装备必须配备以下紧急装备：1、急救箱，包括常用的和特殊的解毒剂2、合适的灭火器和灭火毯建议配备以下设备，但可根据具体情况有所不同：1、全套防护服（连体防护服、手套和头套用于涉及危险度3 级和4 级微生物的事故）2、带有能有效防护化学物质和颗粒的滤毒罐的全面罩式防毒面具（full-face respirator）3、房间消毒设备，如喷雾器和甲醛熏蒸器4、担架5、工具，如锤子、斧子、扳手、螺丝刀、梯子和绳子6、划分危险区域界限的器材和警告标示。清除局部环境的污染需要联合应用液体和气体消毒剂来清除实验室空间、用具和设备的污染。清除表面污染时
19、可以使用次氯酸钠（NaOCl）溶液；含有1有效氯的溶液适于普通的环境卫生设备，但是当处理高危环境时，建议使用高浓度（5 g/L）溶液。用于清除环境污染时，含有3过氧化氢的溶液也可以作为漂白剂的代用品。可以通过加热多聚甲醛或煮沸福尔马林所产生的甲醛蒸气熏蒸来清除房间和仪器的污染。这是一项需要由专门培训的专业人员来进行的、非常危险的操作。产生甲醛蒸气前，房间的所有开口（如门窗等）都应用密封带或类似物加以密封。熏蒸应当在室温不低于21且相对湿度70%的条件下进行。清除污染时气体需要与物体表面至少接触8 h。熏蒸后，该区域必须彻底通风后才能允许人员进入。在通风之前需要进入房间时，必须戴适当的防毒面具。
20、可以采用气态的碳酸氢铵来中和甲醛。采用过氧化氢溶液对小空间进行气雾熏蒸同样有效，但需要专门的蒸气发生设备。清除生物安全柜的污染清除级和级生物安全柜的污染时，要使用能让甲醛气体独立发生、循环和中和的设备。应当将适量的多聚甲醛（空气中的终浓度达到0.8%）放在电热板上面的长柄平锅中（在生物安全柜外进行控制）。然后将含有比多聚甲醛多10%的碳酸氢铵置于另一个长柄平锅中（在生物安全柜外进行控制）。在柜外将该平锅放置到第二个加热板上，在安全柜外将电热板接上插头通电，以便需要时在柜外通过开关电源插头控制盘子的操作。如果相对湿度低于70，在使用强力胶带如管道胶带（duct tape）密封前部封闭板前，还要在
21、安全柜内部放置一个开口的盛有热水的容器。如果前部没有封闭板，则可以用大块塑料布粘贴覆盖在前部开口和排气口以保证气体不会泄漏进入房间。同时供电线穿过前封闭板的穿透孔须用管道胶带密封。将放有多聚甲醛平锅的加热板插上插头接通电源。在多聚甲醛完全蒸发时拔掉插头以断电。使生物安全柜静置至少6 h。然后给放有第二个平锅的加热板插上插头通电，使碳酸氢铵蒸发。然后拔掉电插头，接通生物安全柜电源两次，每次启动约2 秒钟来让碳酸氢铵气体循环。在移去前封闭板（或塑料布）和排气口罩单前，应使生物安全柜静置30min。使用前应擦掉生物安全柜表面上的残渣。洗手清除手部污染处理生物危害性材料时，只要可能均必须戴合适的手套。
22、但是这并不能代替实验室人员需要经常地、彻底地洗手。处理完生物危害性材料和动物后以及离开实验室前均必须洗手。大多数情况下，用普通的肥皂和水彻底冲洗对于清除手部污染就足够了。但在高度危险的情况下，建议使用杀菌肥皂。手要完全抹上肥皂，搓洗至少10 秒钟，用干净水冲洗后再用干净的纸巾或毛巾擦干（如果有条件，可以使用暖风干手器）。推荐使用脚控或肘控的水龙头。如果没有安装，应使用纸巾或毛巾来关上水龙头，以防止再度污染洗净的手。如上所述，如果没有条件彻底洗手或洗手不方便，应该用酒精擦手来清除双手的轻度污染。热力消毒和灭菌加热是最常用的清除病原体污染的物理手段。“干”热没有腐蚀性，可用来处理实验器材中许多可耐
23、受160或更高温度24 h 的物品。燃烧或焚化（见下）也是一种干热方式。高压灭菌的湿热法则最为有效。煮沸并不一定能杀死所有的微生物或病原体，但如果其他方法（化学杀菌、清除污染、高压灭菌）不可行或没有条件时，也可以作为一种最起码的消毒措施。灭菌后的物品必须小心操作并保存，以保证在使用之前不再被污染。高压灭菌压力饱和蒸汽灭菌（高压灭菌）是对实验材料进行灭菌的最有效和最可靠的方法。对于大多数目的，下列组合可以确保正确装载的高压灭菌器的灭菌效果：1、134、3min2、126、10min3、121、15min4、115、25min焚烧在处理那些经过或事先未经清除污染的动物尸体以及解剖组织或其他实验室废
24、弃物时，焚烧是一种有效的方法（见第3 章）。只有在实验室可以控制焚烧炉的条件下，才能用焚烧代替高压灭菌来处理感染性物质。需要有效控制温度，并配备二级焚烧室时才能实现彻底焚烧。许多焚烧炉，尤其是那些只有单个焚烧室的，不能满足处理感染性物质、动物尸体和塑料制品的要求。这些材料可能不能完全销毁，微生物、有毒化学品和烟尘还可能通过烟囱排放而污染大气。但也有许多结构令人满意的焚烧室。理想的是一级焚烧室的温度至少应达到800，二级焚烧室的温度至少应达到1000。需要焚烧的材料（即使事先已清除污染）应当用袋子运送到焚烧室，最好使用塑料袋。负责焚烧的工作人员应当接受关于如何装载和控制温度等的正确指导。还需要注
25、明的是，焚烧炉的操作是否有效主要取决于对需要处理的废弃物中物品的正确混合。人们已经关注到现有的或计划制造中的焚烧炉可能对环境造成的负面影响，并正努力使焚烧炉对环境的影响更小，也更节约能源。废弃物处理实验室和医学废弃物的处理要遵守各个地区、国家和国际的规定，在设计和执行关于生物危害性废弃物处理、运输和废弃的规划之前，必须参考最新版的相关文件。一般情况下，焚烧炉内的灰烬可以作为普通家庭废弃物处理并由地方有关部门运走。高压灭菌过的废弃物可以在其他地方焚烧后处理，或在指定垃圾场掩埋处理。化学品的储存实验室应该只保存满足日常使用量的化学品。大量的化学品应储存在专门指定的房间或建筑物内。爆炸性化学品叠氮化
26、物通常用作溶液中的抗菌剂，由于轻微碰撞就可能造成叠氮化铜的猛烈爆炸，因此叠氮 化物不应该与铜或铅（如污水管以及管道设施）接触。乙醚老化和干燥形成结晶后极不稳定，可能会爆炸。高氯酸如果在木制品、砌砖或纤维性物质上干燥时，一旦碰撞会发生爆炸并引起火灾。苦味酸和苦味酸盐在加热和撞击时会发生爆炸。化学品溢出实验室化学品的大多数生产商都会发行描述化学品溢出处理的示意图，溢出处理的示意图和工具盒都能买到。应该将适当的示意图张贴在实验室中显著的位置，并应配备下列物品：1、化学品溢出处理工具盒2、防护服，例如耐用橡胶手套、套鞋或橡胶靴、防毒面具3、铲子和簸箕4、用于夹取碎玻璃的镊子5、拖把、擦拭用的布和纸6、
27、桶7、用于中和酸及腐蚀性化学品的苏打（碳酸钠，Na2CO3）或碳酸氢钠（NaHCO3）8、沙子（用于覆盖碱性溢出物）9、不可燃的清洁剂。当发生大量化学品溢出时，应该采取下列措施：1、通知有关的安全官员2、疏散现场的闲杂人员3、密切关注可能受到污染的人员4、如果溢出物是易燃性的，则应熄灭所有明火，关闭该房间中以及相邻区域的煤气，打开窗户（可能时），并关闭那些可能产生电火花的电器5、避免吸入溢出物品所产生的蒸气6、如果安全允许，启动排风设备7、提供清理溢出物的必要物品火的危害实验室安全官员与地方消防官员之间的紧密合作是极为必要的。除了化学危害以外，也必须考虑火对感染性物质播散的可能影响。这将可能决
28、定灭火或控制火灾何为最佳。最好由地方消防官员协助对实验室成员进行火灾发生时的应急行动和如何使用消防器材等方面的消防培训。在每个房间、走廊以及过道中应设置显著的火警标志、说明以及紧急通道标志。在实验室中引起火灾的通常原因包括：1、超负荷用电2、电器保养不良，例如电缆的绝缘层破旧或损坏3、供气管或电线过长4、仪器设备在不使用时未关闭电源5、使用不是专为实验室环境设计的仪器设备6、明火7、供气管老化锈蚀8、易燃、易爆品处理、保存不当9、不相容化学品没有正确隔离10、在易燃物品和蒸气附近有能产生火花的设备11、通风系统不当或不充分。消防器材应放置在靠近实验室的门边，以及走廊和过道的适当位置。这些器材应包括软管、桶（用于装水和沙子）以及灭火器。灭火器要定期进行检查和维护，使其维持在有效期内。电的危害对所有电器设备都必须定期进行检查和测试，包括接地系统。在实验室电路中要配置断路器和漏电保护器。断路器不能保护人，只是用来保护线路不发生电流超负荷从而避免火灾。漏电保护器用于保护人员避免触电。实验室的所有电器均应接地，最好采用三相插头。实验室的所有电器设备和线路均必须符合国家电气安全标准和规范。