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1、实验六实验六 大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒DNA的提取及检测的提取及检测基础性实验基础性实验 实验目的实验目的 掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒掌握碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理和方法。的原理和方法。 掌握离心机、移液器、震荡培养箱的正确使用方法。掌握离心机、移液器、震荡培养箱的正确使用方法。 了解不同构型的质粒了解不同构型的质粒DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的在琼脂糖凝胶中泳动速率的差异。差异。实验原理实验原理 质粒是存在于细菌染色体外的能够自主复制的环状质粒是存在于细菌染色体外的能够自主复制的环状DNA分子。大小在分子。大小在1200kb之间，质粒之间，质粒DNA通常通常以游离状态持续稳定地处
2、于染色体外（在一定的条以游离状态持续稳定地处于染色体外（在一定的条件下又会可逆地整合到寄主染色体上），随着染色件下又会可逆地整合到寄主染色体上），随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。由体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。由于质粒于质粒DNA自身具有复制原点、可携带外源基因、自身具有复制原点、可携带外源基因、转移性强、拷贝数高、带有选择性标记等特点，使转移性强、拷贝数高、带有选择性标记等特点，使得质粒成为基因工程中最常用的得质粒成为基因工程中最常用的DNA载体。载体。实验原理实验原理 l质粒质粒DNA分子具有分子具有3种不同的构型：种不同的构型：SC构型构型：共价闭合环形：共
3、价闭合环形DNA（cccDNA），质粒的），质粒的两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构；两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构；OC构型构型：开环：开环DNA（ocDNA），质粒的两条多核苷），质粒的两条多核苷酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链存在一酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链存在一处至多处断裂；处至多处断裂；L构型构型：线性：线性DNA（linear DNA），质粒），质粒DNA发生双发生双链断裂而形成线性分子。链断裂而形成线性分子。实验原理实验原理 l同一质粒同一质粒DNA的不同构型尽管相对分子质量相同，的不同构型尽管相对分子质量相同，但在琼脂糖凝胶电泳中的电泳迁移率却是不
4、同的。一但在琼脂糖凝胶电泳中的电泳迁移率却是不同的。一般情况下，泳动速率由快至慢依次为：超螺旋质粒般情况下，泳动速率由快至慢依次为：超螺旋质粒（SC）、线性质粒（）、线性质粒（L）、开环质粒（）、开环质粒（OC）。）。l质粒质粒DNA的提取方法较多，要根据宿主菌和质粒的的提取方法较多，要根据宿主菌和质粒的特性选择适合的提取方法。目前常用的质粒提取方法特性选择适合的提取方法。目前常用的质粒提取方法有：有：碱裂解法碱裂解法、煮沸法煮沸法。l几种方法的提取流程是一样的：培养细菌扩增质粒几种方法的提取流程是一样的：培养细菌扩增质粒收集菌体裂解细胞收集菌体裂解细胞分离和纯化质粒分离和纯化质粒DNA。 碱
5、裂解法实验原理碱裂解法实验原理 利用共价闭合环状质粒利用共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体与线状的染色体DNA片段在拓扑学上片段在拓扑学上的差异进行分离。的差异进行分离。SDS使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形成蛋白质成蛋白质-SDS复合物。同时，在复合物。同时，在pH12.012.5的碱性条件下，线的碱性条件下，线状的染色体状的染色体DNA变性，而共价闭环质粒变性，而共价闭环质粒DNA虽然氢键断裂，但两虽然氢键断裂，但两条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入pH4.8的醋酸钾高的醋酸钾高盐缓冲液使盐缓冲液使
6、pH降低后，质粒降低后，质粒DNA的两条互补链由于彼此靠近而迅的两条互补链由于彼此靠近而迅速准确地复性，而线状的染色体速准确地复性，而线状的染色体DNA由于核苷酸链较长且两条互由于核苷酸链较长且两条互补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成网状结补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成网状结构，并与变性的蛋白质及细胞碎片等缠绕在一起。通过离心，染构，并与变性的蛋白质及细胞碎片等缠绕在一起。通过离心，染色体色体DNA网状聚合物便与蛋白质网状聚合物便与蛋白质-SDS复合物及不稳定的大分子一复合物及不稳定的大分子一起沉淀下来，而留在上清液中的质粒起沉淀下来，而留在上清液中的质粒D
7、NA可用苯酚、氯仿进一步可用苯酚、氯仿进一步抽提纯化，通过异丙醇沉淀后可收集质粒抽提纯化，通过异丙醇沉淀后可收集质粒DNA。实验原理实验原理 电泳：带电荷的物质在电场中向与自身电荷相反电泳：带电荷的物质在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象称为电泳。的电极移动的现象称为电泳。在在pH8.0的电泳缓冲液体系中，的电泳缓冲液体系中，DNA分子带负电分子带负电荷，当它处于一个稳定的电场中时，从负极向正荷，当它处于一个稳定的电场中时，从负极向正极泳动，迁移速度与其相对分子质量的对数成反极泳动，迁移速度与其相对分子质量的对数成反比（仅适于线性分子）。比（仅适于线性分子）。通过与已知浓度和相对分子质量大
8、小的标准通过与已知浓度和相对分子质量大小的标准DNA片段进行对照电泳，观察其带型和迁移距离，即片段进行对照电泳，观察其带型和迁移距离，即可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量。可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量。 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测实验材料、主要仪器及试剂实验材料、主要仪器及试剂 实验材料实验材料 prok2系列质粒系列质粒 主要仪器和用具主要仪器和用具 超净工作台、振荡培养箱超净工作台、振荡培养箱 、微量移液器、微量移液器、 离心机、涡旋离心机、涡旋振荡器、制冰机、振荡器、制冰机、 离心管架、离心管架、1.5mL离心管、吸头、离心管、吸头、PE手手套、储冰盒、套、储
9、冰盒、电泳槽、电源、电泳槽、电源、微波炉、凝胶成像系统。微波炉、凝胶成像系统。 试剂试剂（1）溶液溶液：50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖 25 mmol/L TrisHCl（pH8.0） 10 mmol/L EDTA（pH8.0） 灭菌后灭菌后4保存保存（2）溶液溶液：0.2mol/L NaOH 1% SDS（pH值值12.6）（3）溶液溶液：5mol/L KAc 60ml 冰乙酸冰乙酸 11.5ml 水水28.5ml（pH4.8）（4）LB培养基培养基（5）琼脂糖琼脂糖（7）1TAE电泳缓冲液电泳缓冲液（pH 8.0）：）：10 mmol/LTrisCl 1 mmol/L EDTA （8）上
10、样缓冲液（溴酚蓝上样缓冲液（溴酚蓝（9） 溴化乙锭（溴化乙锭（1mg/ml）实验步骤实验步骤1. 菌体的培养与收集菌体的培养与收集（1 1）从）从LBLB平板上挑细菌单菌落，接种于平板上挑细菌单菌落，接种于5ml5ml附加相应抗生附加相应抗生素的素的LBLB液体培养基中，液体培养基中，37250r/min37250r/min，过夜培养，过夜培养（用对（用对数期的菌液提取质粒得率高，即测定培养液的数期的菌液提取质粒得率高，即测定培养液的ODOD620620=0.2=0.20.60.6时为对数期的菌液。也可取时为对数期的菌液。也可取1/1001/100的过夜的过夜菌液，继续摇瓶培养菌液，继续摇瓶培
11、养2.5h2.5h，此时菌液达对数期）。，此时菌液达对数期）。（2 2）取）取1.2ml1.2ml菌液放在菌液放在1.5ml1.5ml的离心管中，的离心管中，5000r/min 45000r/min 4离心离心10min10min，弃上清，弃上清（上清液中含有细菌生长过程中的代（上清液中含有细菌生长过程中的代谢废物和脱落的细胞壁成分，会影响到质粒的质量与内谢废物和脱落的细胞壁成分，会影响到质粒的质量与内切酶酶切的效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除切酶酶切的效果。所以离心收集细菌时，上清液应去除干净，最好用干净，最好用STESTE或生理盐水再悬浮漂洗菌体或生理盐水再悬浮漂洗菌体）。收集菌）。
12、收集菌体后选择以下方法提取质粒。体后选择以下方法提取质粒。实验步骤实验步骤2.质粒质粒DNA的提取（碱裂解法）的提取（碱裂解法）将收集的细菌沉淀悬浮于将收集的细菌沉淀悬浮于100l100l冰预冷的冰预冷的溶液溶液中，强中，强烈振荡混匀；烈振荡混匀；加入加入200ul200ul新配的新配的溶液溶液于细菌悬液中，迅速颠倒离心管于细菌悬液中，迅速颠倒离心管5 5次（不应振荡），以混合内容物，室温放置次（不应振荡），以混合内容物，室温放置5min5min或冰上或冰上放置放置3min.3min.加入加入150l150l预冷的预冷的溶液溶液，盖紧管口，颠倒离心管，盖紧管口，颠倒离心管5 51010次，使溶
13、液次，使溶液在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，随后将管置于冰上管置于冰上5 510min10min。 实验步骤实验步骤 12 000 rpm12 000 rpm离心离心10 min10 min，将上清液转移至另一新离心管，将上清液转移至另一新离心管中。中。 加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min10 min。 12 000 rpm12 000 rpm离心离心10 min10 min，弃上清。，弃上清。 加入加入500 l500 l 70 70乙醇，盖紧管盖，颠倒并旋转离心管乙醇，盖紧管盖，颠倒并旋转离心管以洗涤沉
14、淀。以洗涤沉淀。 12 000 rpm12 000 rpm离心离心2 min2 min，用移液器吸走上清，打开管盖，用移液器吸走上清，打开管盖于室温下放置于室温下放置10-15 min10-15 min，使酒精挥发干净。，使酒精挥发干净。 待沉淀干燥后，加入待沉淀干燥后，加入50 l50 l TE TE缓冲液溶解质粒缓冲液溶解质粒DNADNA。3.琼脂糖凝胶电泳检测（琼脂糖凝胶电泳检测（合并下次一起电泳合并下次一起电泳） （1）凝胶制备凝胶制备 取琼脂糖取琼脂糖0.8g0.8g，加入，加入100ml100ml的的1 1TAETAE电泳缓冲液，配成浓电泳缓冲液，配成浓度为度为0.8%0.8%的琼
15、脂糖凝胶。的琼脂糖凝胶。微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全溶微波炉加热煮沸，使琼脂糖完全溶解（注意不要溅出）。解（注意不要溅出）。待凝胶溶液冷却至待凝胶溶液冷却至 6060左右时，加左右时，加入溴化乙锭至终浓度为入溴化乙锭至终浓度为0.5g0.5gmlml，倒进制胶模具中。，倒进制胶模具中。 室温下待凝胶溶液完全凝固，小心取出梳子，将带有凝胶室温下待凝胶溶液完全凝固，小心取出梳子，将带有凝胶的模具的模具放置于电泳槽中。放置于电泳槽中。实验步骤实验步骤 （2）上样上样 在在DNADNA样品中加入样品中加入1 16 6体积的上样缓冲液，充分混匀。用体积的上样缓冲液，充分混匀。用移液器将移液器将DNADN
16、A样品加入样品孔中。样品加入样品孔中。 （3）电泳电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，负极为黑接通电泳槽与电泳仪的电源，一般正极为红色，负极为黑色，色，DNADNA样品由负极往正极泳动。电压降选择为样品由负极往正极泳动。电压降选择为l l5V5Vcmcm（长度以两个电极之间的距离计算），电泳的时间根据不（长度以两个电极之间的距离计算），电泳的时间根据不同的胶浓度与胶长度而异。同的胶浓度与胶长度而异。 （4）观察结果观察结果 电泳结束后取出胶膜，使用凝胶成像系统拍照电泳结束后取出胶膜，使用凝胶成像系统拍照, ,观察。对观察。对比标准比标准DNADNA条带和未知条带和未知DNADNA条
17、带，观察其带型和迁移距离，条带，观察其带型和迁移距离，即可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量大小。即可获得未知样品的浓度、纯度和相对分子质量大小。称琼脂糖称琼脂糖加加TAE加热溶解加热溶解加加EB灌胶灌胶凝固凝固放入电泳槽放入电泳槽加溴酚蓝加溴酚蓝点样点样电泳电泳观察拍照观察拍照质粒质粒DNA 电泳检测过程示意图电泳检测过程示意图质粒质粒DNA注意事项注意事项 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）是一种强诱变剂，致癌物质，是一种强诱变剂，致癌物质，并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应带并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应带手套。手套。 电泳时凝胶的上样孔端在电泳槽阴极，电泳时凝胶的上样孔端在电泳槽阴极，DNA从阴极向阳极泳动。从阴极向阳极泳动。思考题思考题（1 1）质粒）质粒DNADNA有哪几种构型？其电泳时的泳有哪几种构型？其电泳时的泳动速率如何？动速率如何？（2 2）碱裂解法提取质粒）碱裂解法提取质粒DNADNA的原理是什么？的原理是什么？