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1、!-实验一 糖和蛋白质的理化性质检验（4学时）第一部分 蛋白质的理化性质第一节 蛋白质的颜色反应一、实验目的 掌握鉴定蛋白质的原理和方法。 二、实验原理 蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 三、实验器材与试剂 实验器材 1. 鸡蛋1个2. 吸管1.0mL（1）3. 试管 .5cm15cm（2）4. 试管架5. 试管夹2个6. PH试纸（5-7）7. 水浴锅实验
2、试剂 1.卵清蛋白液：将鸡（鸭）蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，离心，上清液冷藏备用。2.1%茚三酮溶液： 1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。3.浓硝酸： 比重1.42。 4.10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100mL。 四、实验方法 A. 黄色反应 蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物（苯及苯丙氨酸较难硝化，需用浓硫酸促进之。反应如下：操作方法：于一试管内，置蛋白质溶液10滴及浓硝酸5滴，加热，冷却后再加10NaOH溶液20滴，观察颜色变化。 B. 茚三酮反应 蛋白质与茚三酮共热，
3、则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色。操作方法：取1mL蛋白质溶液置于试管中，加3-5滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。注意：此反应必须在pH57进行。C.双缩脲反应（参考实验） 将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应（双缩脲反应可用以鉴定蛋白质是否完全水解，及用比色法作蛋自质之定量测定）。其反应式如下：操作方法：1.取少许结晶尿素放在干
4、燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出之氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10NaOH溶液1mL摇匀，再加2滴1硫酸铜溶液，混匀，观察有无紫色出现。2.另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10NaOH溶液10滴及硫酸铜溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。注意：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用，生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42，妨碍此颜色反应的观察。 第二节 蛋白质的沉淀反应一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应。2.进一步掌握蛋白质的有关性质。 二、实验原理多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或
5、与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。蛋白质沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构改变很小或基本没有改变，仍然保持原来的生物活性，只要消除沉淀因素，沉淀会重新溶解而成原来的胶体溶液。不可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构发生了较大的改变，蛋白质已失去了原来的生物活性，即使沉淀因素消失后，沉淀也不会重新溶解。三、实验器材与试剂 实验器材1.试管 1.5cm15cm（5）。 2.吸管5.0L（2），2.0L（3），1.0L（1）。3.玻璃漏斗5cm 1个。4.滤纸9cm1张。实验试剂1.蛋白质试液：见蛋白质颜色反应实验中的卵清蛋白液。2.硫酸铵晶体： 如
6、颗粒太大，最好研碎。3.饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100L加硫酸铵至饱和（硫酸的饱和度：707g/1000mL）。4.95乙醇。5.结晶氯化钠。6.1%醋酸溶液：冰醋酸1L用蒸馏水稀释至100L。7.5鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至100L。 四、实验方法 A. 蛋白质盐析作用 向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。操作方法： 1.取蛋白质溶液4mL，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50饱和），微微摇动试管，使溶液混和静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。分取一半混合液，加水观察沉淀是否溶解。2.将混合液的另一半过滤，滤液中加硫酸铵
7、粉末（约0.8g），至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。注意：(1)应先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液；(2)固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。 B. 乙醇沉淀蛋白质 乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。操作方法：取蛋白质溶液1L，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95乙醇3mL混匀。观察有无沉淀析出。C. 生物碱试剂沉淀蛋白质 植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉
8、淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。 操作方法：取1支试管，加入2L蛋白质溶液及1醋酸溶液4-5滴，向一管中加5鞣酸溶液58滴，观察结果。D.重金属盐沉淀蛋白质（参考实验）蛋白质与重金属离子（如Cu2,Ag，g2等）结合成不溶性盐类而沉淀。操作方法：取试管2支各加蛋白质溶液2mL，一管内滴加醋酸铅溶液，另一管内滴加 1%CuSO4溶液，至有沉淀生成。第二部分 糖的理化性质第一节 糖的颜色反应A. 莫氏试验一、实验目的掌握莫氏（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。 二、实验原理 糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与-萘酚生成紫红色缩合
9、物。利用这一性质可以鉴定糖。三、实验器材与试剂实验器材1.棉花或滤纸。2.吸管 1.0L（4）、 2.0L（1）。3.试管1.5cm15cm（4）。4.水浴锅实验试剂1.莫氏试剂： 称取-萘酚5g，溶于95乙醇并稀释至100L。 此试剂需新鲜配制，并贮于棕色试剂瓶中。 2.1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100L。3.1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100L。4.1%淀粉溶液：将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆状物， 然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。5.浓硫酸 四、实验方法于4支试管中，分别加入1mL 1%葡萄糖溶液、1%
10、蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1mL水中），然后各加莫氏试剂滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加人浓硫酸1.5mL（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫红色环出现。注意：1. 一些非糖物质（如糠醛、糖醛酸等）亦呈阳性反应。此外，样液中如含高浓度有机化合物，将因浓硫酸的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。2. 亦可用麝香草酚或其他苯酚化合物代替-萘酚，麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。3. 莫氏试剂应直接滴入试液中，勿使试剂接触试管壁，否则试剂会与硫酸接触生成绿色而掩盖紫色环 。B. 杜氏试验一、实验目的掌握杜氏（Toll
11、en）试验鉴定戊糖的原理和方法。二、实验原理戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质：本试验虽常用以鉴定戊糖，但并非戊糖特有反应。果糖、半乳糖和糖醛酸等都呈阳性反应。戊糖反应最快，通常在45s内即产生红色沉淀。 三、实验器材与试剂实验器材1.吸管 1.0mL（1）2.试管 1.5cm15cm （3）3. 水浴锅。实验试剂1.杜氏试剂：1%间苯三酚乙醇溶液（2 g间苯三酚溶于100mL95乙醇中） 3mL，缓缓加入浓盐酸15mL及蒸馏水9mL即得，临用时配制。 2.1%阿拉伯糖溶液： 称取阿拉伯糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。3.1%葡萄糖溶液：见试验A。4.1%半乳
12、糖溶液： 称取半乳糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。四、实验方法于3支试管中各加入杜氏试剂1mL，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。各试管同时放入沸水浴中，观察颜色变化并记录颜色变化时间。C. 塞氏试验 （参考实验）一、实验目的掌握塞氏(Seliwanoff)试验鉴定酮糖的原理和方法。二、实验原理酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5一羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应； 有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。以糖为例，其反应如下。三、实验器材与试剂实验器材1.移液管 0.5mL（3），5.0mL（1）2.试管1.5cm15 cm（3）。
13、3.水浴锅。实验试剂1.塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100mL盐酸中（V（H2O）:V（HCl）2:1），临用时配制。 2.1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。3.1%葡萄糖溶液：见试验A。4.1%蔗糖溶液：见试验A。四、实验方法于3支试管中分别加入1%葡萄糖溶液、 1%蔗糖溶液和 1%果糖溶液各0.5mL，各加塞氏试剂2.5mL，摇匀，同时置沸水浴内。比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。注意：在此实验条件下，蔗糖有可能水解成果糖与葡萄糖，而呈阳性反应。葡萄糖与麦芽糖亦呈阳性反应，但呈色反应的速度较酮糖缓慢。果糖的红色出现及沉淀的产生，应在加热后20-30s内，生成的
14、沉淀能溶于乙醇并成红色溶液。第二节 糖的还原作用一、实验目的掌握用糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。二、实验原理费林（Fehling）试剂和本尼迪特（Benedict）试剂均为含Cu2的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O（由于沉淀速度不同，形成的颗粒大小不同，颗粒大的为红色，小的为黄色。）此法常用作还原糖的定性或定量测定。 其反应表示如下： 目前临床上多用本尼迪特法，此法具有如下优点：试剂稳定，不需临用时配制；不因氯仿的存在而被干扰；肌酐或肌酸等物质所产生的干扰程度远较费林试剂小。 三、实验器材与试剂实验器材1.移液管 1.0mL（3）、 2.0mL
15、（）。2.试管1.5cm15cm （3）。3.水浴锅。4.试管架。实验试剂1.本尼迪特试剂： 称取 85g柠檬酸钠 （Na3C6H3O711H2O）及50g无水碳酸钠，溶解于400mL蒸馏水中。另溶解8.5g硫酸铜于50mL热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。2.费林试剂 （参考实验）试剂A：称取硫酸铜（CuSO45H2O）34.5g，溶于蒸馏水并稀释至500mL。试剂B：称取氢氧化钠125g，酒石酸钾钠137g，溶于蒸馏水并稀释至500mL。临用时将试剂A与试剂B等体积混合。3.1淀粉溶液：将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混和成薄浆
16、状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100mL。4.1蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。5.1葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100mL。四、实验方法取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL， 然后每管加本尼迪特试剂2mL，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。 另于3支试管中加人费林试剂A和B各mL，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1mL，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化（此为参考实验，本实验不做）。五、实验报告1.内容与要求：实验目的、实验原理、主要实验仪器设备与试剂、实验步骤、实验现象、结果分析与讨论。2.思考题（1）双缩脲、茚三酮、黄色反应适用鉴别的对象是什么？（2）什么叫蛋白质的变性？盐、乙醇、重金属、生物碱沉淀蛋白质反应哪些是可逆反应，哪些是不可逆反应？（3）莫氏、塞氏、杜氏颜色反应适于鉴别哪类糖？ （4）比较斐林和本尼迪特试剂法有何异同？