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1、细菌的革兰氏染色法细菌的革兰氏染色法一、目的要求一、目的要求学习并掌握革兰氏染色的方法。二、实验材料二、实验材料1.菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金 黄色葡萄球菌。2.染料：草酸铵结晶紫液、路哥氏碘 液、95%乙醇、番红液。3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒 精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲 苯等。三、基本原理三、基本原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。的一种鉴别染色法。1884年由丹麦医师年由丹麦医师Gram创立。创立。细菌先经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌紫色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大
2、类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G-）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色，碱性番红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽孢的杆菌和绝阴性菌则被染上红色。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数成革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成负反应。致病性的无芽孢杆菌都成负反应。 革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化革兰式阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色学组成和生理性质上
3、有很多差别，染色反应不一样。反应不一样。 一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度低，吸附染色，阴性菌复合物结合程度低，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。据。 另外，与细菌细胞壁的化学组成及结另外，与细菌细胞壁的化学组成及结构有关。构有关。革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高，革兰氏阳性细菌由于细胞壁肽聚糖含量高，脂类含量低，乙醇处理使细胞壁脱水，肽脂类含量低，乙醇处理
4、使细胞壁脱水，肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫碘聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫碘复合物被保留在细胞内，细胞不被脱色。复合物被保留在细胞内，细胞不被脱色。v革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高，革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量高，肽聚糖含量较低，乙醇溶解了脂类物质，肽聚糖含量较低，乙醇溶解了脂类物质，使细胞壁通透性增加，结晶紫使细胞壁通透性增加，结晶紫碘复碘复合物易被抽出，于是被脱色。合物易被抽出，于是被脱色。 再有阳性菌菌体等电点较阴性菌低，再有阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料较多，因此不易脱去，阴性菌则相性染料较多，
5、因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。反。所以染色时的条件要严格控制。四、方法与步骤四、方法与步骤操作过程如下：操作过程如下：涂片涂片干燥干燥固定固定草酸铵结晶紫染色草酸铵结晶紫染色（1min）水洗水洗路哥氏碘液媒染路哥氏碘液媒染（1min）水洗水洗95%乙醇脱色（乙醇脱色（30s）水洗水洗番红复染（番红复染（1min）水洗水洗干干燥燥镜检。镜检。 关键点：关键点： 严格掌握严格掌握乙醇脱色程度乙醇脱色程度，如脱色过度，如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。时，阴性菌被误染为阳性菌。 菌龄菌龄也影响染色结果，
6、如阳性菌培养也影响染色结果，如阳性菌培养时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，时间很长，或已死亡及部分自行溶解了，都常呈阴性反应。都常呈阴性反应。 五、实验内容五、实验内容1.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡 萄球菌分别进行革兰氏染色。萄球菌分别进行革兰氏染色。2.对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进 行革兰氏染色。行革兰氏染色。大肠杆菌（大肠杆菌（G-）枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（G+）金黄色葡萄球菌与大肠杆菌金黄色葡萄球菌与大肠杆菌六、实验思考题六、实验思考题1.绘出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄绘出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄 球菌的形态图，注明放大倍数及颜色。球菌的形态图，注明放大倍数及颜色。2.为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄一般不能 超过超过24小时？小时？3.你的实验结果与课本中所述是否一致？如果你的实验结果与课本中所述是否一致？如果 不一致，试分析原因。不一致，试分析原因。4.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样 才能确保你的操作正确，结果可靠？才能确保你的操作正确，结果可靠？