《外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录ppt课件.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录ppt课件.pptx（14页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、外周血单个核细胞总RNA的分离纯化及其逆转录实验内容人外周血单个核细胞总人外周血单个核细胞总RNA 的分离的分离和纯化。和纯化。逆转录聚合酶链反应（逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。）。外周血单个核细胞分离的原理人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴细胞淋巴细胞和单核细单核细胞胞。 单核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，因此利用一种介于1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺（ ficoll-hypaque ）分离液作密度梯度离心，离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布，从而分离出PBMC。外周血单个核细胞
2、的分离实验步骤1.吸取2ml淋巴细胞分离液加入5ml塑料试管；2.取抗凝血1ml，用1ml生理盐水稀释混匀，然后沿管壁缓慢加入加入到到淋巴分离液（上层为抗凝血，下层为淋巴细胞分离液）；3. 2500rpm，离心15min(沉降系数不同，而分离出单核细胞)；4. 吸弃最上层血浆，再吸取单核细胞层至一新的5ml塑料试管中，加生理盐水至管口1cm处，混匀后离心，2500rpm，5min；5.吸弃上清，加生理盐水500ml轻柔吹打混匀后，转入1.5ml Ep管中，2500rpm，5min；6.吸弃上清，留细胞沉淀于Ep管中于下一步总RNA的提取。酸性酚法抽提RNA的原理苯酚在酸性条件下既可溶解DNA，
3、又是蛋白变性剂，联用氯仿可使细胞裂解以及蛋白质与RNA分离，最后利用异丙醇沉淀核酸，获的纯化的总RNA。RNA极易降解，因其RNA酶分布广、活性强、且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解，实验中采用多种措施抑制RNA酶的活性，减少RNA的降解。 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC)，一种强烈的烷化剂，能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而以抑制外源RNA酶。 2. 异硫氰酸胍，一种强蛋白变性剂，可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源性RNA酶活性。抑制RNA酶活性的试剂注意事项预防RNase污染1. 人的唾液中含有大量RNase，皮肤中含有RNase和细菌，而霉菌有可能成
4、为RNase来源。2. 要使用灭菌的RNA专用的塑料制品，避免交叉污染。3. RNA在Trizol中不会被RNase污染，我们要注意后续的实验中要使用不含有RNase的塑料制品和玻璃器皿。单核细胞中总RNA提取实验步骤1. 在上述Ep管中加入500ul变性液（Trizol:苯酚+异硫氰酸胍）悬浮细胞，加100ul氯仿，强烈震荡或置漩涡混合器上混匀，冰浴10min。2. 4，12000rpm，离心10min。吸取上层无色水相(含有RNA)转入新的1.5mlEp管中，加入等体积异丙醇，-20，15min。3. 4，12000rpm，离心10min。去上清，加入500ul70%乙醇（不吹打！不吹打！
5、）4，12000rpm，离心10min，去上清，烘干。4. 加10ul DEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解RNA。逆转录-PCR的原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物，利用逆转录酶特异性地反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因。转录产物具有连续的氨基酸编码区，不需要进行剪接，可在原核细胞中表达。完整的逆转录反应体系除需要逆转录酶，适当的反应缓冲液，RNA模板，逆转录酶及四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）外，还需加入RNase抑制剂。 本实验利用人外周单个核细胞中RNA逆转录成cDNA，然后再以此cDNA为模板，利用特
6、异性引物，通过PCR选择性扩增细胞因子的cDNA序列。实验步骤逆转录逆转录反应体系：MgSO4 2 ml2bcast Buffer 5 mldNTP 0.5 mlRNasin 0.5 mlRandom primer 0.5 ml样品总RNA 1.5 ml 总体积 10 ml反应条件：65oc 1min30oc 5min30oc-65oc 15min-30min(匀速升温）98oc 5min5oc 5min实验步骤 PCR扩增反应体系：10Buffer 2 mlMg2+ 1.5 mldNTP 2 mlcDNA 5 mlTaq 0.2 mlprimer 2 mlddH2O 17.3 ml总体积 30 ml 反应条件： 94 5min 94 45s 56 30s 72 30s 72 5min 4 保存30c结果与分析PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，标明目的条带，非目的条带。具体实验结果分析，如果实验失败，请分析原因，按实际实验出发。