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1、目录摘要3前言51 材料和方法61.1 菌种61.2 仪器61.3 试剂61.3.1甘氨液体发酵基本培养基61.3.2 反应底物乳化液61.3.3 甘氨酸- 氢氧化钠缓冲溶液71.3.4 0.05 mol/L 氢氧化钠溶液71.3.5测定酶液的制备71.4 试验方法72 主要实验操作流程及具体步骤72.1 实验造作流程72.2原始培养基酶活的测定72.2.1 原始培养基72.2.2 酶活的测定82.2.3酶活的计算82.3正交实验82.3筛选最优培养基下微生物产低温脂肪酶的最适温度92.4 不同体积装量的培养基的酶活比较92.5不同接种量培养基酶活的比较92.6 不同碳氮源对酶活的影响92.7
2、不同金属对酶活的影响92.8酶学特性的的研究92.8.1 pH的稳定性与最适的pH92.8.2反应温度的稳定性及最适反应温度和时间93 结果与讨论93.1 原始酶活的测定93.2 正交实验103.3 筛选最优培养基下产低温脂肪酶的最适温度及培养时间153.4 不同体积装量的培养基的酶活比较163.5 不同接种量培养基酶活的比较1736 不同碳氮源对酶活的影响183.7 不同重金属对酶活的影响183.8 酶学特性的的研究193.8.1 pH的稳定性与最适的pH193.8.2 反应温度的稳定性及最适反应温度和时间194 结论20参考文献：20谢 辞21低温脂肪酶的研究_实验室发酵条件优化及酶学特性
3、的研究摘要：本研究以羊粪中筛选出的产低温脂肪酶的菌作为研究对象，研究其产生的低温脂肪酶的实验室发酵条件的优化及酶学特性的研究，其中实验室的发酵条件的优化包括：试剂的优化即采用缓冲液与乳化液混合后再吸取，同时对乳化液进行快速搅拌,有利于乳化液均匀分散, 提高了酶的反应速度和活力；发酵培养液的优化即以原始培养基为基础做正交试验筛选出最适的培养基，并与原培养基的酶活比较；培养环境的优化即筛选最适的温度、最适装量、最适接种量、最适的碳氮源、及一些常见金属离子对产酶的影响；酶学特征的的研究即pH的稳定性与最适的pH以及反应温度的稳定性及最适反应温度和时间。结果表明最是培养基为蛋白胨2%，氯化钠0.005
4、%，氯化钙0.005%，吐温80 0.1%。最适培养温度为30、最适装量40 mL、最适接种量为10%、最适碳源山梨醇、最适氮源硫酸铵、金属离子Ba2+、 Mg2+、 AL3+ 、Fe2+ 、Mn2+、 Ca2+等会提高酶的活性， Zn2+、 Ni2+、Cu2+、 Co2+对脂肪酶的活性有抑制作用。最适pH为8.0，在30时，30min水浴中此酶的酶活最高关键字：低温脂肪酶；发酵条件优化；酶学特征；优化The research of low-temperature lipaselaboratory fermentation conditions optimization and enzymol
5、ogy characteristicsZhujing Summary: The study of producing lipase by sheep were screened for the bacteria as the research object, study on the optimization of fermentation conditions and enzyme properties of laboratory research on low-temperature lipase produced by the optimization of fermentation c
6、onditions, which include: laboratory reagent optimization using buffer solution and emulsion mixed after the draw, while the emulsion rapid mixing, is conducive to the emulsion dispersed, increased the enzyme reaction speed and vigor; liquid fermentation optimization to the original medium based ort
7、hogonal tests showed that the optimum medium, and medium and Yuan Pei activity comparison; culture environment optimization is screening the best temperature, the optimum volume, inoculum size, carbon and nitrogen sources, the optimum and some common metal ions on enzyme; enzymatic characteristics o
8、f the study is the stability of the pH and the optimum pH and temperature stability and the optimum reaction temperature and time. The results showed that the culture medium for 2% of peptone, 0.005% sodium chloride, calcium chloride 0.005%, Twain 800.1%. The optimum culture temperature was 30 , the
9、 optimum quantity of 40 mL, the optimum inoculation was 10%, the optimum carbon source sorbitol, the optimum nitrogen source ammonium sulfate, metal ions Ba2+, Mg2+, AL3+, Fe2+, Mn2+, Ca2+ can improve the activity of enzyme, inhibit Zn2+, Ni2+, Cu2+, Co2+ on lipase activity.The optimum pH is 8.0, at
10、 30 water bath for 30min of this enzyme, the highest enzyme activityKeywords: Low-temperature lipase; Fermentation conditions optimization; Enzymology characteristics; Optimization 前言低温酶多来源于嗜冷微生物(Psychrotoerants)和耐冷微生物(Psychrophiles)。海洋的低温环境较多,生活着数目巨大的低温微生物,为低温酶产生菌的筛选提供了丰富的资源。国外筛选的海洋低温碱性脂肪酶产生菌株的研究较多
11、1,国内关于低温碱性脂肪酶的报道较少,仅孙谧分离得到了一株海洋酵母分泌低温碱性脂肪酶2。嗜冷或者耐冷微生物是低温脂肪酶的目前最主要的潜在来源。研究发现，不同特殊环境分离得到的低温微生物，其所产脂肪酶的热稳定性、最适 pH 等特性上有很大不同，目前国内外关于低温脂肪酶产生菌的报道多来自极地3-4和深海海泥中5。迄今为止研究的低温脂肪酶都是由低温微生物分泌产生的。这些微生物主要分布于南、北极以及大洋底部等温度较低的区域。Morita根据生长温度的上限不同,将低温微生物分为适冷菌(psy-chrotroph)和嗜冷菌(psychrophile)。适冷菌是指在0能够生长,但最适生长温度在2030之间,
12、极限生长温度在40的一类微生物;嗜冷菌是指温度低于0时能缓慢生长,最适生长温度低于15,而高于20不能生长的一类微生物。低温微生物代表着已开始探索,但尚未完全认识的一个新的微生物领域。低温微生物脂肪酶由于具有低温高催化活性,耐有机溶剂以及对热敏感等特点,在食品、洗涤、制药、脂类加工、低温环境修复等方面有着巨大的应用潜力。其催化作用广泛性和巨大的工业化潜力，及它不需要辅酶等优势使它在生物合成和生物转化中具有诱人的前景。尤其值得关注的是,由于大多数低温脂肪酶都有着接近自然环境温度的最适酶活反应温度,因此它们在环境修复领域大有用武之地,不仅可用于去除低温状态下工业废物中的油脂,诸如脂类加工所产生的含
13、脂废物和饮食业产生的含油脂废物等,还可以处理大量的城市和生活含脂废水和废物。用低温脂肪酶处理这些含脂废弃物时,所需附加的热能低,且安全、高效,不会造成二次污染,对环境保护有非常积极的意义。总之,低温脂肪酶由于在低温下的高催化特性,在工业上有着越来越广泛的应用前景。近年来,随着对低温脂肪酶研究的深入,我们相信在不久的将来会有更多的低温脂肪酶应用于各工业领域。1 材料和方法1.1 菌种在羊粪中筛选出H11菌种，并且研究其低温脂肪酶的活性。1.2 仪器4高速冷冻离心机、可调温度的恒温箱、恒温水浴锅、高速组织破碎机、紫外灯无菌操作台。1.3 试剂1.3.1甘氨液体发酵基本培养基蛋白胨 1%、NaCl
14、0.5%、CaCl2.7H2o 0.01%、Tween80 1%、蒸馏水配制，Ph7.0以上。1.3.2 反应底物乳化液 称取 30 g 聚乙烯醇(PVA), 加 900 mL 水, 加热溶解, 冷却后用 6mol/L 氢氧化钠调至 pH 10.0, 过滤, 定容至 1 000mL。取上述 PVA 溶液 150 mL, 加入橄榄油 50 mL,用高速组织捣碎机搅拌 6 min, 8 000 r/min, 前后各3 min, 间隔 5 min, 液备用。1.3.3 甘氨酸- 氢氧化钠缓冲溶液 配制0.2 mol/L 甘氨酸和 0.2 mol/L 氢氧化钠, 再根据所需 pH 值配制不同的缓冲液。
15、1.3.4 0.05 mol/L 氢氧化钠溶液 称取4.5 g固体氢氧化钠溶于1 L水中, 用 0.1 mol/L 的邻苯。1.3.5测定酶液的制备 将产酶的菌接入液体培养基培养，酶液即取此菌的发酵液。1.4 试验方法发酵液中脂肪酶酶活的测定采用经典的聚乙烯醇橄榄油乳化液方法6。根据杨华7等改进的方法，采用缓冲液与乳化液混合后再吸取有利于减少误差, 同时对乳化液进行快速搅拌,有利于乳化液均匀分散, 提高了酶的反应速度和活力。2 主要实验操作流程及具体步骤2.1 实验造作流程原始培养基（测定酶活）正交实验（筛选出最适培养基）筛选最适碳氮源筛选最适金属离子测定酶学特性（各项稳定性的测定）2.2原始
16、培养基酶活的测定2.2.1 原始培养基蛋白胨 1%、NaCl 0.5%、CaCl2.7H2o 0.01%、Tween80 1%、蒸馏水配制，将pH调到7.0以上，在4、10、15分别测定酶活以筛选出在那个温度下酶活较高。将培养液均装入100mL的三角瓶，每瓶装50mL,并且用高温高压灭菌锅灭菌8，将灭过菌的培养基取出，在30以下的温度，按10%的接种量在无菌间中接种。在接种中药避免污染。将接种后的三角瓶，放置于30,150rpm的摇床上，40h后测定酶活。通过正交试验设计对该菌株进行产酶条件进行优化9，得到最适产酶条件。2.2.2 酶活的测定在三角瓶中加入一定量混合均匀的缓冲溶液和乳化液的混合
17、液, 放入一定温度的恒温水浴锅中, 再加入酶液反应并计时, 一定时间后终止反应, 用 0.05 mol/L 氢氧化钠滴定游离出的脂肪酸, 同时做空白样( 先加终止剂, 后加酶液, 其余同样品操作)。水解释放出的脂肪酸以1%酚酞(加2滴)为指示剂,0.05NNaOH为滴定液进行滴定,出现微红色时为终点。2.2.3酶活的计算 酶活 U= (V- V0)/t 50 n其中: V-样品所消耗碱的体积, mL;V0-空白消耗碱的体积, mL;t-反应时间, min;50-1 mL 0.05 mol/L 氢氧化钠的微摩尔数;n-稀释倍数。2.3正交实验在上述原始培养基的不同温度培养下，找出最适的温度后，每
18、个元素上下各加减0.5%个单位的量做正交。正交表如下正交表编号蛋白胨氯化钠氯化钙吐温80111112212233133412235223163212713328231393321按照这个正交表，不断的筛选，直到筛出最优培养基。2.3筛选最优培养基下微生物产低温脂肪酶的最适温度将实验筛选出的最适培养基与原始培养基对比培养，并且分别放置于4、15、30恒温箱中，测定脂肪酶活性。以得出提高温度后此酶的最适温度。2.4 不同体积装量的培养基的酶活比较将装量设置为每10mL为一个单位的装量测酶活，分别设置为10、20、30、40、50、60、70、80 ml,测其最适的装量。2.5不同接种量培养基酶活的
19、比较将原始培养基中分别接种2%、4%、6%、8%、10%的菌种，测定酶活，筛选最适的接种量。2.6 不同碳氮源对酶活的影响在原始培养基中加入不同的碳源0.5%，选择的是：麦芽糖、果糖、葡萄糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖、淀粉。在原始培养基加入不同的氮源1%，选择的氮源有：酵母膏、蛋白胨、硫酸钾、硫酸铵、牛肉膏。2.7不同金属对酶活的影响不同的常用金属离子，分别加入原始的培养基10，加入浓度为4mmol/L。参照高修功11等所做脂肪酶特性研究实验，选择的金属离子有：Ba2+ Mg2+ AL3+ Zn2+ Ni2+ Fe2+ K+ Cu2+ Mn2+ Cr3+ Co2+ Na+ Ca2+以不添加的
20、作为对照。2.8酶学特性的的研究2.8.1 pH的稳定性与最适的pH取酶液2mL与等体积的pH 2-10的各种缓冲液混匀后，在40存放24h后，用0.5mol/L的NaoH或Hcl pH至7.5，测定残留酶活力。 2.8.2反应温度的稳定性及最适反应温度和时间在30、40、50、60、70、80水浴60min,每隔15min取样一次，取样后立即冰浴。取完样待到所有酶样的温度达到一致时测定酶活。3 结果与讨论3.1 原始酶活的测定原始培养基：蛋白胨 1%、NaCl 0.5%、CaCl2.7H2o 0.01%、Tween80 1%、蒸馏水配制，Ph7.0以上。表3-1 原始培养基的酶活（%）时间/
21、h41015990.000.331001230.631.662.191472.332.993.671713.193.663.661952.962.991.99图3-1 原始培养基的酶活实验得出的结论是15、 10、4依次达到最高酶活，且15不但在最短时间即147小时率先达到最高峰并且酶活比其他两个温度都高（如图和表3-1所示）。3.2 正交实验脂肪酶筛选培养基1蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8010.500.010.5210.30.02131.50.50.031.2表3-2-1脂肪酶筛选培养基（%）正交实验表蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8065h89h113h137h161h10.500.010.51.33
22、0.674.323.0010021.000.021.03.331.670.661.332.3131.500.031.20.660.331.001.670.6640.50.30.021.20.661.000.671.030.3351.00.30.030.50.670.3301.000.6761.50.30.011.01.331.320.330070.50.50.031.02.310.331.000.660.6781.00.50.011.20.001.000.330.670.6691.50.50.020.51.000.330.660.671.33图3-2-1 脂肪酶筛选培养基（%）正交实验1的酶活
23、正交实验一得出的结论是一号培养基在113小时达到最高峰，并且远远高出其他的8个培养基（如表和图3-2-1所示）。脂肪酶培养基筛选（%）2蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8010.20.100.520.50.20.010.730.70.30.0150.1表3-2-2 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表2蛋白胨氯化钠氯化钠吐温80酶活（U/mL）30 150rpm 40h10.20.100.51.6520.50.10.0100.71.9830.70.10.0150.10.6640.20.20.010.10.6650.50.20.0150.50.6660.70.200.71.3270.20.30.0150.70
24、.3380.50.30.010.10.9990.70.30.010.52.31原1.00.50.011.01.65图3-2-2 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验2的酶活根据正交实验一的结果，将一号培养基作为中见量，继续做正交实验二，实验二可由图看出，9号培养基的酶活最高达到了2.31U/ml（如表和图3-2-2所示）。脂肪酶培养基筛选（%）3蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8010.50.20.0050.420.70.30.010.531.20.50.020.8表3-2-3 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表3蛋白胨氯化钠氯化钙吐温80酶活（U/mL）30 150rpm 42h10.50.20.0050.4
25、0.9920.70.20.010.5031.20.20.020.81.6540.50.30.010.80.3350.70.30.020.41.3261.20.30.0050.50.6670.50.50.020.50.6680.70.50.0050.81.6591.20.50.010.42.97图3-2-3 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验3的酶活根据实验二中得出的最高酶活是9号培养基，将9号培养基作为中间量，再一次构建正交。实验三，得出最高酶活是9号培养基，酶活达到了2.97 U/ml（如表和图3-2-3所示）脂肪酶培养基筛选（%）4蛋白胨氯化钠氯化钙吐温80110.30.0050.121.20
26、.50.010.231.50.80.020.3表3-2-4 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验表4蛋白胨氯化钠吐温80酶活（U/mL）30 150rpm 40h110.30.0050.12.3321.20.30.010.23.3331.50.30.020.34.00410.50.010.33.3351.20.50.020.13.3361.50.50.0050.24.66710.80.020.24.0081.20.80.0050.33.0091.50.80.010.15.33原9号1.20.50.010.43.33图3-2-4 脂肪酶培养基筛选（%）正交实验4酶活通过正交实验3得出的最高酶活是9号培
27、养基，所以由9号培养基为中间量，继续做正交试验，正交试验4中得出9号培养基的酶活最高，达到了5.33U/ml（如表和图3-2-4所示）。脂肪酶培养基筛选(%)正交实验5蛋白胨氯化钠氯化钙吐温8011.20.50.005021.50.80.0100.132.01.00.0200.2表3-2-5 脂肪酶培养基筛选(%)正交实验表5蛋白胨氯化钠氯化钙吐温80酶活（U/mL）30 150rpm 42h11.20.5000.00503.9621.50.8000.0100.12.5432.01.0000.0200.22.0641.20.0200.0100.22.7451.50.0100.02004.626
28、2.00.0050.0050.16.9971.20.0200.0200.11.9881.50.0050.0050.23.4292.00.0100.01003.33原9号1.50.0100.0100.14.93图3-2-5 脂肪酶培养基筛选(%)正交实验酶活通过正交实验5得出结论，6号培养基的酶活最高达到了6.991 U/ml（如表和图3-2-5所示）。3.3 筛选最优培养基下产低温脂肪酶的最适温度及培养时间图3-3-1 不同温度下静置6号培养基的酶活图3-3-2 原始培养基在不同温度下的酶由上实验可得出正交试验5中的6号培养基的酶活最高，正好在正交试验的中心，与原培养基的酶活相比较较为明显（如
29、图3-3-1、图3-3-2所示）。6号培养基酶活达到6.991 U/mL。3.4 不同体积装量的培养基的酶活比较3-4 不同体积装量的设置体积（mL）40h64h88h103.334.334.99202.663.3333.69302.663.6634.32403.994.3295.99503.964.3294.88603.634.3295.96703.333.6634.89803.333.6634.85图3-4 不同体积装量的培养基的酶活比较实验结果表明，40mL体积装量的酶活相比较其他装量而言最高（如表和图3-4所示）。3.5 不同接种量培养基酶活的比较图3-5 不同接种量的酶活比较实验表明
30、接种量为10%时，酶活最高（如图3-5所示）。36 不同碳氮源对酶活的影响图3-6-1 不同碳源（原始培养基中加不同的碳源0.5%）结果表明碳源加山梨醇远远高于其他的碳源（如图3-6-1所示）。图3-6-2 不同氮源（原始培养基中加不同的氮源1%）的酶实验表明，硫酸铵远远高于其他的氮源（如图3-6-2）3.7 不同重金属对酶活的影响图十二 不同的常用金属离子的酶活图3-7 不同重金属对酶活的影响由未添加金属离子为参照，可以得出，Ba2+、 Mg2+、 AL3+ 、Fe2+ 、Mn2+、 Ca2+等会提高酶的活性，而Mn2+、 Ca2+的影响较大，Ca2+影响最大，活性也最高。另一方面也可以看出
31、Zn2+、 Ni2+、Cu2+、 Co2+对脂肪酶的活性有抑制作用。其中K+、Cr3+与未添加的持平，说明这些金属离子对酶活既没有抑制也没有促进的作用（如图十二）。3.8 酶学特性的的研究3.8.1 pH的稳定性与最适的pH图3-8-1 pH稳定性与最适pH的酶活结果表明，此酶作用的最适pH为8.0，最具有稳定性（如图3-8-1）。3.8.2 反应温度的稳定性及最适反应温度和时间表3-8-2 反应温度的稳定性及最适反应温度和时间温度/时间15min30min45min60min304.835.995.665.32404.985.324.994.67504.995.225.324.99605.3
32、24.994.664.32705.324.994.664.32805.274.974.323.49图3-8-2 反应温度的稳定性及最适反应温度和时间结果表明在30时，30min水浴中此酶的酶活最高。但是在高温中的酶活也不是非常低，也显出了耐高温性。4 结论通过实验得出结论正交实验的最适培养基为：蛋白胨2%，氯化钠0.005%，氯化钙0.005%，吐温80 0.1%。最适培养温度为30、最适装量40 mL、最适接种量为10%，碳源加山梨醇远远高于其他的碳源，氮源中硫酸铵远远高于其他的氮源。装量为40 mL为最适装量，10%的接种量为最宜。添加金属离子测定其对酶活的影响：由未添加金属离子为参照，可
33、以得出，Ba2+、 Mg2+、 AL3+ 、Fe2+ 、Mn2+、 Ca2+等会提高酶的活性，而Mn2+、 Ca2+的影响较大，Ca2+影响最大，活性也最高。另一方面也可以看出Zn2+、 Ni2+、Cu2+、 Co2+对脂肪酶的活性有抑制作用。其中K+、Cr3+与未添加的持平，说明这些金属离子对酶活既没有抑制也没有促进的作用。此酶作用的最适pH为8.0，最具有稳定性。30时，30 min水浴中此酶的酶活最高。但是在高温中的酶活也不是非常低，也显出了耐高温性。参考文献：1 李艳华,张利平.海洋微生物资源的开发与利用J.微生物学通报,2003,30(3):113-115.2 董宏伟,孙谧,王跃军等
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37、论文的工作是在老师的悉心指导下完成的，老师严谨的治学态度和科学的工作方法给我极大的帮助和影响。在论文完成之际，衷心感谢一年来老师对我的关心和指导。在本文的撰写过程中，老师在学术上，论文结构安排上，提出许多宝贵意见，以及师兄在实验中的帮助和指导，在此表示衷心的感谢。其次，我要感谢我的同窗好友，在这么一个日子了，他们要么忙着找工作，要么准备重整旗鼓，明年在战，经济上的压力，学业上的孤独和艰辛，他们需要的是闲暇而不是繁重的额外劳动。但是高山流水般四年的友谊，使他们放弃了“浮生半日之闲”，为我论文的完成收集资料，提供意见，在此深深向他们表达感激之情。然后，我要感谢我的父母。他们把我从馄饨未知的世界带来，赋予我生命，让我感受到阳光，享受的雨露。看到这色彩斑斓的妙不可言的世界。二十多年来，成功时他们为我鼓掌喝彩，失利时他们为我加油鼓劲。同样这篇论文的完成也离不开他们的经济和感情上的支持。“谁言寸草心，报得三春晖”，母爱情深，父爱情深。最后，衷心感谢在百忙之中抽出时间来评阅论文和参加答辩的各位专家、教授。19