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1、课题3分解纤维素的微生物分离,棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外木材、作物秸秆也富含纤维素。纤维素可用于纺织工业，造纸、发酵等,由葡萄糖首尾相连形成的大分子有机化合物，是地球上含量最多的多糖类物质。,一、实验原理,1、纤维素（C6H10O5)n,（一）纤维素和纤维素酶,思考：1.纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？,4060%能被土壤中的某些微生物分解利用。,2.这些微生物为什么能分解纤维素呢？,这些微生物能够合成纤维素酶。,能分解纤维素的微生物包括各种细菌（纤维单胞菌属、纤维弧菌属、噬胞菌属、芽孢梭菌属等）、真
2、菌(霉菌)和少数放线菌。除此之外还存在于草食动物消化道中的一些微生物，如牛、羊、兔等，为厌氧型细菌。,2、纤维素酶,纤维素酶不是单一酶，是复合酶，包括C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。,（1）人能不能对纤维素消化吸收？为什么？,不能，因为人体不能合成纤维素酶。人以淀粉为主要的能量来源。,思考：,（2）食物中的纤维素有什么作用？,食物中的膳食纤维可刺激胃肠蠕动和分泌消化液，有助于食物的消化和排泄。,取二支20mL的试管,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶，甲试管中加入。,两支试管固定在锥形瓶中，放在140
3、r/min的摇床上振荡1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：（1）步骤中应加入什么？（2）甲试管的作用是什么？该实验的自变量是什么？,3、纤维素酶作用的测定实验：,如何检测纤维素被纤维素酶分解成了葡萄糖？,加入斐林试剂，水浴加热，观察有无砖红色沉淀生成。,下列生物能分解纤维素的是（）人兔牛蘑菇纤维杆菌,A.B.,C.D.,C,（二）纤维素分解菌的筛选,2、筛选原理：,1、筛选方法：,刚果红（CR）是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖产生这种颜色反应,阅读教材P28，找出以下内容：,刚果红染色法,通过产生的透明圈来筛选纤维素分解菌,加入刚果红
4、,红色复合物,红色复合物无法形成,出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,纤维素,纤维素被纤维素酶分解,筛选过程：,练一练：,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是,A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是（）,A.刚果红能与纤维素形成红色复合物B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,三、实验设计,1、实验流程,思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些
5、异同？,课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本实验是先通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。,思考1：你认为应在何种环境中容易获得纤维素分解菌？为什么？,（1）土壤取样：,2、操作步骤,富含纤维素的环境中。如：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。原因：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,思考2:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土
6、壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,具体操作：（1）称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL选择培养基的摇瓶中。（2）将摇瓶置于摇床上，在30下振荡培养12d，至培养基变混浊。（3）吸取一定的培养液（约5mL），转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。,（2）选择培养,培养基成分分析,碳源（能源）,氮源、无机盐,无机盐,生长因子、碳源（少量）、氮源,氮源、生长因子,水,提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照,或者将纤
7、维素改为葡萄糖。,A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）,B、这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。酵母膏可以提供少量碳源，其他微生物也可以生长繁殖，但是其含量很少不能大量繁殖，只有纤维素分解菌才能大量繁殖。,C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,B.为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速的繁殖。而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起
8、到浓缩的作用。,思考：A.在梯度稀释前进行选择培养的目的是什么？增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌接入在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,比较课题2与课题3的选择培养基,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101107倍。,(3)梯度稀释,(4)将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,.制备培养基:参照旁栏中的比例,鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),涂布平板：将鉴别培养基平板和不含纤维素的培养基平板分别标号，分别将稀释度为106104的
9、菌悬液各取0.1mL，对号滴加到鉴别培养基平板和不含纤维素的培养基平板上，并用涂布器均匀涂布。将培养基平板于30C倒置培养,至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板,(5)挑选产生透明圈的菌落,挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C370C培养，可获得纯培养。,【资料三】刚果红染色法,方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应,方法二：在倒平板时就加入刚果红,方法一中NaCl溶液的作用？,思考：,漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。用这方法可以判断酶活力的大小，实际上刚果红是结合到培养基的多糖底物，但分
10、解纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物成为单糖，这样刚果红就不能结合上去了，氯化钠溶液就可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈，大的透明圈当然分解纤维素的能就强！,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便，不存在菌落混杂问题,产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,思考：这两种方法各有哪些优点与不足,试验结果,实验组：,鉴别培养基上，经刚果红染色法，菌落周围将会出现明显的透明圈,对照组：,不含纤维素的培养基经刚果红染色法，菌落周围不出现明显透明圈,在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲
11、酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,（四）、结果分析与评价,1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。2.分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远
12、远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实验，纤维素酶的发酵方法有_发酵和_发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_含量进行定量测定。,课题延伸,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化活力,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,挑选菌落,稀释与涂布,前置染色法后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课堂总结,1、刚果红是一种酸性染料，能将下列哪些物质染色（）,纤维二糖葡萄糖纤维素苏木精弹性纤维,B、,A、,C、,D、,D,2、分离土壤中纤维素分解菌用到的方法（）稀释倒平板法涂布平板法单细胞挑取法选择培养基法,A、,B、,C、,D、,B,D,3、选择培养时应将锥形瓶固定在()A桌子上B温箱里C窗台上D摇床上,B,4、选择培养的结果：培养液变()A清澈B浑浊C红色D产生透明圈,C,5、刚果红染色时，加入刚果红可在()制备培养基时梯度稀释时倒平板时涂布时培养基上长出菌落时ABCD,A,6、两种刚果红染色法的结果是()A均会出现透明圈B均不会出现透明圈C方法一出现，方法二不出现D方法一不出现，方法二出现,