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1、课题1：微生物的实验室培养,微生物,：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称,微生物包含了除植物界和动物界以外的所有生物,病毒：DNA病毒（T2噬菌体）、RNA病毒（SARS、烟草花叶HIV、流感）,原核生物：细菌、放线菌、衣原体、支原体、蓝藻,真核生物：（酵母菌、霉菌、食用菌）,原生生物：单细胞动植物（草履虫、单细胞藻类）,病毒,酵母菌,放线菌,霉菌,细菌,上图都是一些常见的微生物，微生物是结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，与人类关系密切。人工的培养和分离，使得我们更进一步认识微生物。,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态
2、结构的子细胞群体，叫做菌落。,有些细菌（多为杆菌）在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体。每一细胞仅形成一个芽孢，所以其没有繁殖功能。,1.芽孢,脱离亲本后能直接或间接发育成新个体的生殖细胞。它是有丝分裂或减数分裂的产物；,2.孢子,3.菌落,菌落,细菌的菌落特征因种而异,培养基（培养液）：人们按照微生物对的不同需求，配制出供其的营养基质,营养物质,生长繁殖,（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基.半固体培养基。（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分分：天然培养基和合成培养基。,1.培养基的类型,固体培养基：菌落,用途：纯化（分离），鉴定
3、、活菌计数、保藏菌种,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,用途：增菌、工业生产,半固体培养基：,无动力有动力(弥散),用途：观察微生物的运动、鉴定菌种等,选择培养基,1.加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌2.加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌3.无氮培养基:分离固氮菌4.不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物5.加入四环素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,细菌喜荤，霉菌喜素,1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成,问题1：培养基包括哪些基本成分？,问题2：从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含
4、有这些营养成分？,水、碳源、氮源、无机盐,C、H、O、N、P、S是构成细胞原生质的主要元素，约占原生质总量的97以上。,1.基本成分：,碳源、氮源、水、无机盐,碳源,无机碳源：,有机碳源：,CO2、CO32-、HCO3-,牛肉膏、蛋白胨等,自养微生物,异养微生物,氮源,无机氮源：,有机氮源：,NH4、NO3-,牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等,注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源,2.特殊营养物质（生长因子）：微生物生长必需，而又无法合成。,维生素、氨基酸、碱基等,3.pH、氧气的需求：,真菌偏酸，细菌偏碱,1.概念：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方
5、法。无菌操作是培养微生物成功的关键！,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,消毒是指杀灭病原微生物的方法，灭菌是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽孢、孢子）的方法,温和,强烈,部分微生物,全部微生物,不能,能,煮沸消毒法:100煮沸5-6min巴氏消毒法：70-75下煮30min或80下煮15min化学药剂消毒法:用75%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源紫外线30min消毒：照射前，可喷石炭酸或煤酚皂等消毒液加强消毒效果,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,3.常用的消毒与灭菌的方法,(2)灭菌的方法：,灼烧灭菌：接种环、接种针、试管口、瓶口,干热灭菌：玻璃器皿和金属用具,高压蒸气灭菌
6、：培养基100kPa、121下维持15-30min,a.灼烧灭菌,3.常用灭菌的方法,b.干热灭菌：160-170下加热1-2h。c.高压蒸汽灭菌：100kPa、121下维持15-30min.,问题1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,还能有效避免操作者自身被微生物感染。,问题2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿；（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管；（3）实验操作者的双手,（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,1.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法
7、依次用于杀灭哪些部位的杂菌()A.接种环、手、培养基B.高压锅、手、接种环C.培养基、手、接种环D.接种环、手、高压锅,【典型例题】,【方法点拨】灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手和衣着需要消毒处理。,C,2.微生物培养过程中，要十分重视无菌操作。现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染。请分析下列操作中错误的是()煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢接种操作要在酒精灯火焰附近进行无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒家庭制作
8、葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌培养基要进行高压蒸汽灭菌加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌A.B.C.D.,D,微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存,取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。,LB液体培养基细菌的扩大培养LB固体培养基细菌的划线分离,二.实验操作(以培养大肠杆菌为例),.制备牛肉膏蛋白胨培养基,1.计算2.称量3.溶化：可调节PH4.灭菌:将培养基转移到锥形瓶，再放入高压蒸汽灭
9、菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。培养皿：58套培养皿为一包，包好后放入干热灭菌箱内，在160170灭菌2h5.倒平板待培养基冷却到50左右时，在酒精灯附近倒平板。2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种。,【方法点拨】倒平板的方法及注意事项,在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；,右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；,左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。,待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。,1.培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下
10、降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,最常用的接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法。,1.平
11、板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面。在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落。,1.平板划线的操作方法,平板划线的操作,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规则的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,【注意事项】,1.接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。,2.划线首尾不能相接。,3.划线后，培养皿倒置培养1224h。,从上次的末端开始，交叉23条,最后的划线不能与第一区相连。,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前
12、都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：第一步：灭菌；每次划线前：为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束：后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细
13、菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.稀释涂布平板法,（1）系列稀释操作,将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。,2.稀释涂布平板的操作方法,注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰12cm处.,（2）涂布平板操作,将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中,取少量稀释液滴加到培养基表面,待酒精燃尽后冷却810s,用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想
14、一想，第2步应如何进行无菌操作？,答：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等。,培养基中细菌数目过多或连成一片的原因可能是什么？,答：（1）菌液浓度过高（2）培养过程中被杂菌污染（3）利用接种环划线时，每次划线前未灼烧灭菌,下列关于微生物接种的描述，正确的是()A.平板划线法只用于固体培养基的接种，而稀释涂布平板法只用于液体培养基的接种B.平板划线法不能用于微生物的计数，而稀释涂布平板法可用于微生物的计数C.利用平板划线法不能得到单菌落，而利用稀释涂布平板法能得到单菌落D.平板划线法所用的接种工具不需要灭菌，而稀释
15、涂布平板法所用的接种工具需要灭菌,【方法点拨】这两种接种方法都可用于固体培养基的接种，都能用于形成单菌落，接种器具都要进行严格灭菌处理。,B,1.临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。2.长期保存：甘油冷冻管藏法,1关微生物营养物质的叙述中，正确的是（）A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量,D,解析：A、B选项的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源；有的碳源可同时是氮源；有的碳源同时是能源；有的碳源同时是氮源，也是能源。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（）A.防止杂菌污染B.接种前菌种要进行灭菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前,B,退出,解析：发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），A正确；B错误，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C正确，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,