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1、本 科 生 毕 业 论 文 HPLC法测定橙中类胡萝卜素含量 院 系： 环境与生命科学系 专 业： 应用化学 班 级： 082 学 号： 指导教师： 职称（或学位）： 二零一二年 五 月原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文（设计），是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文（设计）不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本论文（设计）的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学生签名： 年 月 日 指导声明本人指导的 同学的毕业论文（设计）题目大小、难度适当，且符合该同学所学专业
2、的培养目标的要求。本人在指导过程中，通过网上文献搜索及文献比对等方式，对其毕业论文（设计）内容进行了检查，未发现抄袭现象，特此声明。指导教师签名： 年 月 日目 录1 材料与方法21.1 供试材料21.2 主要化学试剂31.3 实验仪器及设备31.4 橙子中类胡萝卜素的提取41.5 定性、定量分析橙子中的类胡萝卜素52 结果与讨论62.1 超声波辅助提取橙中类胡萝卜素的工艺条件筛选62.2紫外-可见吸收光谱初步定性分析102.3纽菠萝橙中类胡萝卜素种类与含量分析103 结论13致谢13参考文献13附录15 HPLC法测定橙中类胡萝卜素含量HPLC法测定橙中类胡萝卜素含量 摘要：本文研究了橙子果
3、肉中类胡萝卜素的提取、分离，并采用高效液相色谱法对果肉中的类胡萝卜素进行定性、定量分析。通过单因素实验研究超声波辅助提取橙中类胡萝卜素的工艺条件分别为：乙醇乙酸乙酯=11，提取温度为30，提取时间为15min，提取次数为2次，料液比为125。利用高效液相色谱技术分析纽菠萝橙果肉中类胡萝卜素组分与含量，其中用流动相甲醇乙腈二氯甲烷（57025）分离出不少于4种物质，经鉴定果肉中含-隐黄质0.591gg-1FW；而以流动相甲醇乙腈二氯甲烷（17812）分离出7种物质，经鉴定果肉中含玉米黄质3.018gg-1FW，-胡萝卜素6.077gg-1FW。关键词：HPLC；橙子；类胡萝卜素HPLC Dete
4、rmination of Carotenoid Content in Citrus Abstract: This paper mainly studied the extraction and separation of caroteniods from the citrus pulp and analysed the types and contents of carotenoids in the citrus pulp using HPLC technology. The single factor experiment results using ultrasonic assisted
5、extraction of caroteniod were as follows: using ethanol-ethyl (11, V/V) extracted twice under the temperature 30 for 15 minutes each and ratio of solid to liquid(g/mL) was 125. At least four kinds of material could be sepatated by HPLC technology using methanolacetonitriledichloromethane (57025,VVV)
6、 as mobile phase. The content of -cryptoxanthin was 0.591gg-1 FW. And at least seven kinds of material could be sepatated using methanolacetonitriledichloromethane (17812,VVV) as mobile phase. The content of zeaxanthin and -carotene were obtained under this condition,which were 3.018gg-1 FW and 6.07
7、7gg-1 FW respectively.Key words: HPLC; citrus; carotenoids橙子(Citrus sinensis)系芸香科柑橘属橙树的果实，是我国东南部特有的珍稀水果，是柚子和橘子的混合杂交品种。橙子根据果肉的酸甜可分为酸橙和甜橙两种，酸橙味酸且苦，多用于榨汁，不宜鲜食。甜橙成熟后，果肉呈现橙黄色，富含酸甜适中的果汁。橙子具有较高的营养价值，含有丰富的维生素C、抗坏血酸、钙、类胡萝卜素等物质1。其中，类胡萝卜素物质的抗氧化功效强，对癌症的发生起到积极的抑制作用。另外，类胡萝卜素是维生素A的前体，对皮肤角化症的治疗起到促进作用2-3；类胡萝卜素可以预防眼科
8、疾病，减少高能量可见光对光感受器的损伤4；类胡萝卜素分子中存在许多不饱和双键，也就意味着其有较强的抗氧化功能，可延缓衰老5；类胡萝卜素可增强免疫力，促进机体产生抗体6。正是由于橙子中丰富的类胡萝卜素的以上优点，故研究橙子中类胡萝卜素的组成和含量具有一定的价值。类胡萝卜素是一类具有生物活性的烯萜类化合物的总称，它们在结构上以异戊二烯残基为单元共轭形成双键长碳链，在链的两个末端各有一个-紫萝酮环，环上的氢原子其所在位置不同，能够被羟基、环氧基和羰基所取代，在乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚以及氯仿等大部分有机溶剂中有较好的溶解性，但不溶于水7-8。根据类胡萝卜素化学结构和溶解性的不同，可分为两类：一类为
9、无氧烃类，即胡萝卜素，如-胡萝卜素、-胡萝卜素、-胡萝卜素、番茄红素等；另一类为胡萝卜素的含氧衍生物，如玉米黄素、叶黄素、辣椒红素、隐黄质等9。橙子中类胡萝卜素为脂溶性色素，主要为-隐黄质、叶黄素、玉米黄质、-胡萝卜素、-胡萝卜素10，不耐光照，其在低温下较稳定，高温环境中易降解；酸性条件下易被破坏，碱性条件对其影响较小；对氧化剂和还原剂的稳定性较低。-胡萝卜素-胡萝卜素叶黄素玉米黄质-隐黄质图1 主要类胡萝卜素物质结构1 材料与方法1.1 供试材料以纽菠萝橙为试验材料，放置于-20冰箱中密封保存。1.2 主要化学试剂表1 实验药品药品生产厂家规格甲醇国药集团化学试剂有限公司色谱纯乙腈天津市化
10、学试剂批发公司色谱纯二氯甲烷天津市科密欧化学试剂有限公司色谱纯乙酸乙酯天津市河东区红岩试剂厂色谱纯-胡萝卜素美国SIGMA公司标准品叶黄素美国SIGMA公司标准品玉米黄质美国SIGMA公司标准品-隐黄质美国SIGMA公司标准品2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚天津市光复精细化工研究所分析纯无水乙醇天津市永大化学试剂有限公司分析纯乙酸乙酯天津市红岩化学试剂厂分析纯丙酮天津市红岩化学试剂厂分析纯石油醚天津市大茂化学试剂厂分析纯正己烷天津市永大化学试剂有限公司分析纯乙醚上海焱晨化工实业有限公司分析纯甲醇天津市化学试剂批发公司分析纯三氯甲烷国药集团化学试剂有限公司分析纯无水硫酸钠浙江省兰溪市二轻试剂厂分析
11、纯碳酸钙天津市化学试剂批发公司分析纯氢氧化钾天津市化学试剂批发公司分析纯氯化钠天津市红岩化学试剂厂分析纯二氧化硅天津市大茂化学试剂厂分析纯1.3 实验仪器及设备表2 实验仪器仪器生产厂家型号超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司KQ5200E型玻璃仪器气流烘干器长城科工贸有限公司星火牌C型电子天平赛多利斯科学仪器（北京)有限公司Sartorius BS124S移液枪上海宙辉生化仪器有限公司WKY型海尔冰箱青岛海尔股份有限公司BCD-215SCX型循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司SHB-旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂RE-52CS-1电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司DHG-9246A
12、型台式高速冷冻离心机上海力申科学仪器有限公司Neofuge 23R紫外可见分光光度计日本岛津公司UV-1750电热恒定水浴锅恒奇企业发展有限公司H.S.G IC-2型石英自动双重纯水蒸馏器常州国华电器有限公司1810-B型高效液相色谱仪美国安捷伦科技有限公司Agilent Lc 1100 1.4 橙子中类胡萝卜素的提取类胡萝卜素的提取工艺有多种，大体上可分为有机溶剂提取法、微波辅助提取法、酶反应法、超临界流体萃取法、超声波辅助提取法11。有机溶剂提取法是直接将有机溶剂加入到提取物中，使所需物质得以分离的一种萃取的方法，它是以上方法中最为基本的一种。相对于其它方法，有机溶剂提取法的效率以及产率都
13、较低，而其它方法需要更多仪器和试剂的供应。综合考虑实验的可行性，本实验采用超声波辅助提取法。超声波辅助提取法作为新型应用技术，在天然物质的有效成分提取上得到推广。其可运用超声波的空化作用12以促进天然物质中欲提取物质的溶解，另外机械振动、扩散等效应也能加快所需成分的释放。与常规有机溶剂提取法相比，超声波辅助提取法提取过程所需时间短、提取效果好、实验条件比较温和。超声波辅助提取法可以在振荡过程中形成小气泡，小气泡在上升阶段逐渐破碎，使小范围内产生冲击波，有效的将植物组织和细胞击碎，从而使有机溶剂与类胡萝卜素物质更好的接触，以达到更佳的提取效果。1.4.1 类胡萝卜素物质的提取称取一定量的纽菠萝橙
14、果肉置于研钵中，迅速按一定的料液比加入含0.1%BHT13的有机溶剂，过程中还应加入少量CaCO3抵消研磨时有机酸的释放，并且加入少量SiO2以利于研磨充分，边研磨边浸提。待果肉研磨匀浆后，将其连有机溶剂一起转入50mL离心管中进行超声波振荡。然后取出离心管在室温下静止冷却至常温。最后在5条件下以6500rpm高速离心5min14，取上清液即可得到类胡萝卜素提取物。1.4.2 超声波辅助提取橙中类胡萝卜素的工艺条件研究（1）纯溶剂的选择称取5g（准确至0.0001g）纽菠萝橙果肉于研钵中，按照15的料液比分别加入含有0.1%BHT的类胡萝卜素常用有机提取溶剂丙酮、石油醚、无水乙醇、乙酸乙酯、无
15、水乙醚、甲醇、三氯甲烷、正己烷15-16，并加入少量CaCO3和SiO2充分研磨。随后在25条件下超声振荡20min，提取1次，待提取液冷却至常温后进行高速冷冻离心，取上清液并同时定容到25mL。最后利用分光光度计在450nm5波长检测类胡萝卜素提取液的吸光度，比较各溶剂提取液的吸光度值，选择最佳提取试剂。（2）混合溶剂的选择由于类胡萝卜素物质种类繁多，采用纯溶剂不可能尽量多的提取橙子中类胡萝卜素物质。为了提高纽菠萝橙果肉中类胡萝卜素的提取效率，本实验将以上述提取效果较好的溶剂与其它溶剂混合，进而考究最佳提取溶剂。采取上述方法，将常用的有机提取纯溶剂改为乙醇乙酸乙酯（11）、乙醇乙酸乙酯（21
16、）、乙醇乙酸乙酯（31）、乙醇乙酸乙酯（12）、乙醇乙酸乙酯（13）、乙醇丙酮（11）、乙醇丙酮（21）、乙酸乙酯丙酮（21）、乙酸乙酯正己烷（11）、乙酸乙酯正己烷（21）517，以上混合液中均含0.1%BHT，进行橙子果肉类胡萝卜素的提取，同样在450nm检测吸光度筛选最佳混合溶剂。从混合溶剂中确定出最佳提取溶剂后，设置单因素实验研究超声振荡温度、超声振荡时间、提取次数、料液比18-19对纽菠萝橙果肉中类胡萝卜素提取效果的影响。（3）超声波振荡温度的选择用最佳提取混合溶剂，分别以20、30、40、50、60、70的超声振荡温度进行提取，比较不同超声振荡温度对纽菠萝橙果肉类胡萝卜素提取的影响
17、。（4）超声振荡时间的选择用最佳提取混合溶剂，在最优超声波振荡温度的条件下，分别以5min、10min、15min、20min、25min、30min的超声振荡时间进行提取，比较不同超声振荡时间对纽菠萝橙果肉类胡萝卜素提取的影响。（5）提取次数的选择用最佳提取混合溶剂，在最优超声振荡温度、超声振荡时间的条件下，分别提取1次、2次、3次、4次，提取的次数大于2次的应合并提取液，再进行浓缩，然后取上清液定容到相同体积，比较不同提取次数对纽菠萝橙果肉类胡萝卜素提取的影响。（6）料液比的选择用最佳提取混合溶剂，在最优超声振荡温度、超声振荡时间的条件下进行2次提取筛选最佳料液比，分别设置15、110、1
18、15、120、125、130、135、140的料液比，比较不同料液比对纽菠萝橙果肉类胡萝卜素提取的影响。经过上述6步的条件筛选，可以得出超声波辅助提取纽菠萝橙果肉中类胡萝卜素的最佳提取溶剂、提取温度、提取时间、提取次数以及提取料液比。取上述各单因素的最佳条件，准确称取10g纽菠萝橙果肉进行超声振荡提取，作为高效液相色谱分析的备用材料。1.5 定性、定量分析橙子中的类胡萝卜素高效液相色谱由于样品用量少、重现性好、分析速度快、分离效率高、自动化程度高等特点，被广泛地应用于天然色素的分离。相比于气相色谱法，高效液相色谱法的限制条件少，例如：样品的挥发性、热稳定性、相对分子质量等均没有要求，只要能把样
19、品配制成溶液即可，适用范围广，对不稳定的天然物质、生物大分子、离子型化合物以及一些高分子化合物的分离均可达到较好的效果。在气相色谱中，常以惰性气体作为流动相，与组分之间没有亲和力，仅起到运载的作用。而高效液相色谱的流动相不仅可以使样品沿着色谱柱方向移动，还能产生与固定相类似的作用与样品分子发生选择性的相互作用20。1.5.1 高效液相色谱检测前的准备工作类胡萝卜素是一大类物质，其中部分以类胡萝卜素酯的形式存在，在提取的过程中它们的存在形式不发生变化，对分离和测定都会造成一定的困扰，因此皂化成为分析类胡萝卜素的重要过程。皂化可以水解大部分的低酯化羟基类胡萝卜素和中性脂，释放出游离态的类胡萝卜素，
20、去除脂肪酸，同时也可以去除部分水溶性、脂溶性杂质，为高效液相色谱更好地分离类胡萝卜素和准确地定量分析做好准备21。将上述类胡萝卜素提取液在35条件下减压蒸干，用20mL石油醚（含0.1%BHT）溶解，装入棕色瓶，再加入20mLKOH甲醇溶液（含0.1%BHT）室温下暗处皂化反应5h。然后向皂化好的液体中加入20mL10%NaCl溶液使之充分萃取分离，用分液漏斗把下层水相分离，水相继续用40mL石油醚（含0.1%BHT）萃取2次，合并石油醚相，用双重蒸馏水反复冲洗直至石油醚相呈中性，分离出石油醚相，加入0.3g无水NaSO4脱水后将提取液在35条件下减压蒸干，用色谱纯的甲醇与乙酸乙酯以11的比例
21、定容至10mL22。1.5.2 紫外可见分光光度法初步定性分析将上述皂化后的纽菠萝橙果肉提取液进行紫外可见分光光度法的吸收光谱分析，并且与类胡萝卜素的特征吸收光谱互相比较，初步判定提取液中的类胡萝卜素物质。1.5.3 高效液相色谱定性定量分析高效液相色谱检测条件为柱型：ZORBAX SB-C18；流速：0.7mLmin-1；检测波长：450nm；进样量：10L；柱温：25。通过改变流动相筛选最佳分析条件。（1） 流动相1：甲醇乙腈水（80155）；（2） 流动相2：甲醇乙腈水（751510）；（3） 流动相3：甲醇乙腈二氯甲烷（57025）；（4） 流动相4：甲醇乙腈二氯甲烷（17812）。以
22、上述4种高效液相色谱条件分析纽菠萝橙果肉提取液的类胡萝卜素物质，并且分别在相同条件下分析-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、-隐黄质4种标准物质，比较分离效果较好的方案进行定量分析。然后，根据先前分析图谱，将标准品稀释成合适的浓度梯度，定量分析提取液主要类胡萝卜素物质的含量。2 结果与讨论2.1 超声波辅助提取橙中类胡萝卜素的工艺条件筛选2.1.1 常用纯溶剂的比较图2 筛选纯溶剂从图2上可以看出，在以上所用的纯溶剂中，无水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、乙醚的提取效果较好，但是考虑到溶剂的价格、毒性等因素，最终决定以乙醇、乙酸乙酯作为较好的提取纯溶剂。2.1.2 常用混合溶剂的比较图3 筛选混合溶剂从图3可
23、以看出乙醇与乙酸乙酯混合（乙醇乙酸乙酯）及乙醇与丙酮混合都能达到超过纯溶剂的提取效果，但是乙醇与乙酸乙酯混合的提取效果更好。另外由于丙酮有一定的毒性，本实验选择乙醇与乙酸乙酯混合提取液。在乙醇与乙酸乙酯混合液（乙醇乙酸乙酯）中以乙醇乙酸乙酯（21）的比例可以略微提高提取液的吸光度，却增大定性分析前提取液旋转蒸发的温度，为了稳定类胡萝卜素物质后续实验中尝试以乙醇乙酸乙酯（11）进行其它因素的考察。2.1.3 提取温度的比较图4 筛选温度从图4可以看出在20-50范围内，随着温度的升高，提取液的吸光度呈现较为平缓的上升趋势，但是考虑到类胡萝卜素物质对温度较为敏感，在高温下不稳定，因此在不影响提取的
24、温度范围内适当低的温度可以保证类胡萝卜素物质较为稳定的存在，本实验以30作为最佳提取温度。2.1.4 提取时间的比较图5 筛选提取时间从图5可以看出在5-15min，提取液的吸光度有明显的上升趋势，15min后时间继续增大，但是提取液的吸光度只是缓慢增加且趋势较小，考虑到效率与长时间超声振荡可能带来的类胡萝卜素损失，折中选取15min作为最佳提取时间。2.1.5 提取次数的比较图6 筛选次数从图6可以看出2次提取后提取液的吸光度已经较高，虽然2次以后的多次提取可以使提取液吸光度略微上升，但是考虑到多次提取过程中的损失，以2次提取作为最佳提取次数。2.1.6 料液比的比较A料液比图7 筛选料液比
25、从图7可以看出在由料液比15到125的过程中，乙醇乙酸乙酯（11）的混合溶剂对纽菠萝橙果肉中类胡萝卜素的提取效果呈现上升趋势，随后料液比继续加大，但提取液吸光度不再增加，即以125为作为最佳提取料液比。综上所述，以单因素实验研究超声波辅助提取纽菠萝橙果肉中类胡萝卜素的工艺条件为：提取溶剂乙醇乙酸乙酯（11），提取温度30，超声振荡时间15min，提取次数2次，料液比125。在单因素实验研究所得的提取工艺基础上，进行果肉提取液的定性定量分析。2.2紫外-可见吸收光谱初步定性分析图8 纽菠萝橙果肉提取液紫外可见吸收光谱图图8为纽菠萝橙果肉提取液紫外可见吸收的光谱分析图。从图上可以看出，提取液在44
26、2、470nm波长处均有较大的吸收峰，在442nm前还有一不完全的肩峰，这是由于类胡萝卜素分子的振动能量使橙子提取液在紫外可见光谱分析中表现出三个明显的吸收峰，而并不是单一峰的谱带，属于典型的类胡萝卜素紫外可见分析图谱的图形8-9，根据光学颜色互补原理，它们分别反射出黄色、橙色。2.3纽菠萝橙中类胡萝卜素种类与含量分析2.3.1 以流动相1定性分析图9 橙子提取样HPLC分析图由图9可以看出以流动相甲醇乙腈水（80155）可以分离出5种物质，用标准品对照时发现标准品叶黄素与玉米黄质的保留时间分别为12.4、12.5min，由于出峰时间相近，故两种同分异构体不易分离，它们分别对应着橙子提取样中的
27、峰、峰，这两种检测出的物质符合陶俊等23在柑橘果实的主要类胡萝卜素成分分析，但两个峰未能完全分离，影响后续定量分析，故不作为分析方案。2.3.2以流动相2定性分析图10 橙子提取样HPLC分析图由图10可以看出以流动相甲醇乙腈水（751510）可以分离出9种物质，用标准品对照时发现标准品-胡萝卜素与叶黄素的保留时间分别为27.2、38.7min，将橙子提取样与标准品对照可判定峰为-胡萝卜素，峰为叶黄素。然而峰与峰在该流动相的分离过程中不能很好的分开，影响结果的定量分析，故不作为分析方案。2.3.3以流动相3定性分析图11 橙子提取样与-隐黄质对照由图11可以看出以流动相甲醇乙腈二氯甲烷（570
28、25）可以分离出不少于3种物质，用标准品对照时发现标准品-隐黄质的保留时间为6.5min，其与图11中峰出峰时间相对应，可判断出橙子提取样中含有-隐黄质。在陶俊等23柑橘果实的主要类胡萝卜素成分分析中提到-隐黄质是柑橘果肉的主要类胡萝卜素之一，故选择该方案针对-隐黄质进行定量分析。2.3.4以流动相4定性分析图12 橙子提取样HPLC分析图图13 橙子提取样-标准品对照图由图12可以看出以流动相甲醇乙腈二氯甲烷（17812）可以分离出7种物质，用标准品对照时发现标准品玉米黄质与-胡萝卜素的保留时间分别为7.8、27.0min，它们分别与图13中峰、峰出峰时间相对应，可判断出橙子提取样中含有玉米
29、黄质与-胡萝卜素。这两种物质也符合陶俊等23在柑橘果实的主要类胡萝卜素成分分析，从图的分离效果看流动相4可以较好的分离出多种类胡萝卜素，故可以取其作为定量分析方案之一。经过上述的4种不同流动相分析可知纽菠萝橙中含有多种类胡萝卜素物质，经鉴定可判断出其中含有玉米黄质、-胡萝卜素、-隐黄质3种类胡萝卜素物质。2.3.5以流动相3、4分别定量分析（1）橙子提取样-隐黄质含量分析图14 -隐黄质标准曲线用积分工具将图11橙子提取样的峰进行峰面积积分，可得其面积为54.1，代入图14-隐黄质标准曲线的线性公式Y=-0.72+92.8X，可计算得纽菠萝橙中-隐黄质的含量为0.591gg-1。（2）橙子提取
30、样玉米黄质含量分析以上述类似的方法可求出玉米黄质标准曲线的线性方程为：Y=13+20.976X（数据参考附表1）。用积分工具将图12中橙子提取样的峰进行面积积分，可得其面积为76.3，代入玉米黄质标准曲线的线性方程Y=13+20.976X，可计算得纽菠萝橙果肉中玉米黄质的含量为3.018gg-1。（3）橙子提取样-胡萝卜素含量分析以上述类似的方法可求出-胡萝卜素标准曲线的线性方程为：Y=-43.13+17.794X（数据参考附表2）。用积分工具将图12中橙子提取样的峰进行面积积分，可得其面积为65，代入-胡萝卜素标准曲线的线性方程Y=-43.13+17.794X，可计算得纽菠萝橙中-胡萝卜素的
31、含量为6.077gg-1。3 结论以单因素实验考察超声波辅助提取纽菠萝橙果肉中类胡萝卜素的工艺条件，结果表明各单因素的较好条件分别为：提取溶剂乙醇乙酸乙酯（11），提取温度30，超声振荡时间15min，提取次数2次，料液比125。提取液经过减压浓缩、皂化后，利用高效液相色谱技术进行分析。在色谱条件：色谱柱ZORBAX SB-C18(5m，4.6150mm)，流速0.7mLL-1，检测波长450nm，进样量10L，柱温27下，用流动相甲醇乙腈二氯甲烷（57025）分析得不少于3种物质，其中-隐黄质0.591gg-1FW；而以流动相甲醇乙腈二氯甲烷（17812）分析得7种物质，其中玉米黄质3.01
32、8gg-1FW，-胡萝卜素6.077gg-1FW。致谢本实验以及论文是在 老师细心指导与帮助下完成的。从选题到中期修正，从实验到论文形成的过程中，老师为我提供了许多的宝贵建议。在实验阶段，老师总能及时解决过程中遇到的问题，有时还会寻求改进方法，以保证实验的进度与质量。在论文修改方面，老师倾注了心血，不仅尽量完善主体，在细节上也注意考究。在老师的指导下，我的思维方式也得以拓展，在实验研究中争取创新与进展。在此我谨向 老师表示崇高的敬意与衷心的感谢！同时，我还要感谢其他老师与同学的帮助。参考文献1 吴桂苹, 苏学素, 焦必宁, 等. 柑橘活性成分检测技术研究进展J. 食品与发酵工业, 2006,
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