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1、蚯蚓抗菌肽的提取及其活性检测摘 要：采用不同的硫酸铵溶液沉淀蚯蚓粗蛋白，来探究硫酸铵浓度对蚯蚓蛋白质抗菌活性的影响；用不同pH的磷酸缓冲液处理蚯蚓粗蛋白沉淀来探究pH对其活性的影响；以及采用稀释法测量蚯蚓抗菌肽达到抑菌效果的最高稀释度。研究表明，80%硫酸铵沉淀的蚯蚓粗蛋白提取液的抑菌效果最好；pH为中性及近中性更易于蚯蚓抗菌肽保持其活性；蚯蚓抗菌肽对G+的抑菌效果比对G-的好。关键词：蚯蚓;抗菌肽;硫酸铵沉淀;抗菌活性Abstract：in order to explore the effect of the different concentrations of ammonium sulf
2、ate on the antibacterial activity of Earthworms protein.so they were extracted by different saturation degree of ammonium sulfate .And we can explore crude protein，s antimicrobial peptide activity of earthworm with a buffer phosphoric acid solution of different pH, and measure the highest dilution o
3、f antimicrobial peptides of earthworm to inhibit the growth of bacterial using dilution. Studies have shown that earthworm，s crude protein extracted buy the 80% ammonium sulfate precipitation has the best inhibitory effect, neutral or nearly neutral pH is better for the activity of the earthworm，s a
4、ntimicrobial peptides, and its inhibitory effect to G+ is better than G-.Keywords: earthworm; antibacterial peptides; precipitating in ammonium sulfate; antibacterial activity0引言蚯蚓是营腐生生活动物，以腐败的有机物为食，生活充满了大量微生物的潮湿环境中却极少得病，这得益于蚯蚓体内独特的抗菌免疫系统1。其中体液免疫很发达，这得益于抗菌肽在其中发挥的重要作用。 抗菌肽（Anti-bacterial peptides）是一类
5、对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，是在诱导的条件下动物免疫防御系统产生的，也是动物免疫防御系统的重要组成部分2。随着对抗菌肽研究的深入，人们发现抗菌肽在动植物和微生物中广泛分布，这些小分子量的多肽抗菌谱广，还可以抗真菌，抗病毒，抗肿瘤，且不易产生抗药性3。国外最早的对蚯蚓抗菌肽的研究是从1985年开始的，Vaillier等人通过国凝胶过滤、色谱聚焦、抑菌活性测定，从蚯蚓的体腔液中提取出了3种活性蛋白，它们均表现出较强的抗菌作用，并且具有红细胞凝聚和溶血的性质，分子量分别为20000Da，40000Da，45000Da，等电点分别为4.9，5.75，6.04。国内直到1995年才有对
6、于蚯蚓抗菌肽的研究报道。林少琴等5将蚯蚓粗提取物用DEAE-SepharoseFF层析柱分离纯化得到3种蛋白，并且通过对各组分进行的抗肿瘤研究，发现其对H22腹水瘤的抑制作用较明显。 目前，在两栖类动物、昆虫、哺乳动物和甲壳类动物中都可以分离出抗菌肽，在鱼类和线虫中也有一些发现。但与其他动物相比蚯蚓来源广，便于养殖，易于处理，为蚯蚓抗菌肽的广泛使用提供了条件。而且蚯蚓抗菌肽主要存在于体腔液中，含量相对较高。因此利用蚯蚓抗菌肽易于诱导的特性，进行蚯蚓抗菌肽的直接提取利用，例如其作为抗生素饲料添加剂代替品，可以有效地防止病原微生物的侵袭，减少药物的耐受性以及药物在人体和动物体残留的问题。因此蚯蚓抗
7、菌肽的研究不仅可行性强，而且具有广阔的前景。1材料与方法11 材料蚯蚓：野生蚯蚓；菌种：圣女果洗脱液中分离的菌种试剂：浓度为50%，60%，70%，80%的饱和硫酸铵溶液PBS缓冲液：每升Nacl 8g；Kcl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g，pH=4.5，6.0，7.5，9.0 ，4预冷LB固体培养基：每升胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl 10g，琼脂粉15g，pH=7.4LB液体培养基：每升胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，Nacl，10g，pH=7.4器材：小烧杯，大烧杯，玻璃棒，剪刀，组织匀浆机，离心管，低温离心机，滴管，电子天平，电磁炉，量筒，容
8、量瓶，锥形瓶，pH试纸，酒精灯，培养皿，接种环，涂布玻棒，移液枪，枪头，滤纸片，冰箱，高压蒸汽灭菌器，恒温培养箱，超净工作台，滤纸，打孔器，酒精棉球12方法1.2.1蚯蚓抗菌肽粗提液的提取将10g鲜活的蚯蚓水中浸泡 24 h，吐出肠道中的泥土。 PBS (pH6.0)清洗干净后，剪取组织后加入 2 倍体积 的4 预冷的 PBS 溶液，充分研磨，4 离心，2000 r/min，离心15 min，取上清液。取4个15ml离心管分别加入6ml上清液并分别缓慢加入等体积的50%，60%，70%，80% 的硫酸铵溶液，混匀后4 静置 4 h， 7000r/min，离心15 min，留取沉淀，将沉淀溶于上
9、述缓冲液中1.2.2纯菌悬液的制备将圣女果洗脱液涂布于LB固体培养基上，37恒温箱中培养24小时，取两种单菌落分别涂布于不同的LB固体培养基平板上，37恒温箱中培养24小时，分别挑去单菌落接种于两个装有20mlLB液体培养基的锥形瓶中，37摇瓶培养8h，获得纯菌悬液。1.2.3涂布法检测蚯蚓抗菌肽的抑菌活性 取纯菌液适量涂布于LB固体培养基上，用无菌滤纸片蘸取蚯蚓抗菌肽粗提液贴于平板上，37恒温培养12h后观察抑菌圈有无及其大小，并记录结果。1.2.4 pH对蚯蚓抗菌肽活性的影响的检测 用蚯蚓抗菌肽抑菌效果最好的硫酸铵浓度以同样方法重新提取蚯蚓粗蛋白于不同pH的磷酸缓冲液，重复步骤3。1.2.
10、5蚯蚓抗菌肽活性的定量检测 将蚯蚓抗菌肽粗提取液进行2倍递减梯度稀释，即稀释液的稀释倍数分别为2、4、8、16、32倍。分别取其稀释液 100 L，加到微量稀释板的加样孔中，然后取100 L从圣女果洗脱液中分离得到的A，B纯菌液(菌液浓度为 106 mL-1)接种于其中，混匀后，37 恒温箱振荡培养 24 h。如有混浊，即表明菌已生长，该稀释度抗菌肽无抗菌作用，以完全无菌生长的最高抗菌肽稀释度度作为该菌对该抗菌肽的最高抑菌稀释度62结果与分析21不同浓度硫酸铵沉淀的蚯蚓抗菌肽粗提液的抑菌现象图1a 图1b 图1c 图1d 图1e图1不同浓度硫酸铵沉淀的蚯蚓抗菌肽粗提液的抑菌现象注：图1a,1b
11、,1c,1d分别为50%，60%，70%，80%浓度的硫酸铵溶液沉淀得到的蚯蚓抗菌肽的抑菌效果，图1e为只加PBS作对照 图1为不同浓度硫酸铵沉淀的蚯蚓抗菌肽粗提液的抑菌现象，由图1可发现用PBS作对照的培养平板中没有抑菌圈的出现，而用不同浓度的硫酸铵粗提的蚯蚓抗菌肽队都具有一定的抗菌作用此可知蚯蚓抗菌肽是一类分子量范围较宽泛的蛋白。但其中用浓度为70%和80%抑菌效果较好，其中用80%硫酸铵溶液沉淀得到的蚯蚓抗菌肽的提取液处理得到的抑菌圈达到10mm。而用浓度为50%和60%硫酸铵溶液沉淀得到的蚯蚓抗菌肽的提取液虽有一定的抑菌作用，但抑菌效果相对较弱。由于不同浓度的硫酸铵沉淀的蛋白质大小不同
12、，所以由此可看出用70%和80%的硫酸铵沉淀得到的蚯蚓蛋白质有更好的抑菌效果。22蚯蚓抗菌肽在不同 pH 下的抑菌效果的比较图2 蚯蚓抗菌肽在 pH为4.5，6.0，7.5，9.0 下的抑菌效果的比较由图2可知在蘸取了pH为4.5和9.0的蚯蚓抗菌肽提取液的滤纸片周围抑菌圈不明显，在pH为6.0和7.5的蚯蚓抗菌肽提取液的滤纸片周围抑菌圈较明显，由此可知不同的pH对蚯蚓抗菌肽的活性有一定的影响，主要表现在强酸强碱会抑制其活性，而中性及近中性条件更有利于蚯蚓抗菌肽保持其抗菌活性。23不同稀释度的蚯蚓抗菌肽对G+和G-的抑菌效果比较图3a 图3b图3 从圣女果洗脱液中分离纯菌落得到的G+和G-的代
13、表菌注：通过革兰氏染色后确定图3a为革兰氏阳性菌，以A菌来表示，图3b为革兰氏阴性菌，以B菌表示（其中具体菌种仍需进一步观察检测）图3中的两种菌为从圣女果洗脱液中分离得到纯菌落，其中A菌落呈毛玻璃状，边缘不整齐，呈卷发状，有一个或数个小尾突起，菌落有粘性，用接种针钩取可拉成丝，革兰氏染色为阳性。B菌落呈圆形小凸起，边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑，半透明，革兰氏染色为阴性。分别挑取A、B菌适量接种于两个装有20mlLB液体培养基的锥形瓶中，摇瓶培养8h的到A菌、B菌纯菌液。表1不同稀释度的蚯蚓抗菌肽对G+和G-的抑菌效果比较蚯蚓抗菌肽稀释度A菌液B菌液原液-1：2-1：4-1：8-1：16-+
14、1：32+注：“-”表示不长菌，“+”表示长菌表1为不同稀释度的蚯蚓抗菌肽提取液对G+和G-的抑菌效果的比较，由表1可看出蚯蚓抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌作用，且随着稀释度的增加其同样可以达到抑菌效果，但抑菌效果逐渐减弱直到32倍稀释后就起不到抑菌的作用了，而且由表1还可发现这次提取的蚯蚓抗菌肽对革兰氏阳性菌的抑菌效果比对革兰氏阴性菌的抑菌效果更好。3讨论31材料的选取蚯蚓抗菌肽是蚯蚓在不良的环境中产生的一种抵御外界伤害的物质，因此可以采用刺激诱导的方式来增加其体内抗菌肽的产生，且抗菌肽是一种蛋白活性物质，因此鲜活的蚯蚓中抗菌肽的活性更强，抑菌效果更好。而且由于野生环境更复杂，更
15、有利于诱导蚯蚓抗菌肽的分泌，因此相对于人工培养的蚯蚓来说野生的鲜活蚯蚓体内的抗菌肽的抗菌活性会更强，也更有利于抑菌活性的观察和测定。为了使提高研究中抑菌效果的可靠性以及防止杂菌的干扰，可采用已确定菌的纯菌液作为受试菌来检测蚯蚓抗菌肽的抑菌活性。32抗菌肽的提取由于抗菌肽主要存在于体液中，所以在研究过程中研磨是否充分对提取出来的抗菌肽的含量也会有一定的影响，所以在冰浴下用组织匀浆机效果会更好。因为蚯蚓粗提液中蛋白质的含量较少而杂质较多，可能对后期的抑菌效果有一定的影响，所以可以先用透析袋将蛋白质提取出来，减少杂质对研究结果的影响。除此之外，在实验条件允许的情况下还可采用超滤、离子交换层析、葡萄糖
16、凝胶G-100层析柱过滤等步骤来进行蚯蚓抗菌肽的精提。由于抗菌肽的大小无法精确测量，所以在离心得到蛋白粗提物时，离心转速的选择也十分重要，在此次研究过程中通过一系列的试验最终确定转速为7000r/min效果最好。33蚯蚓抗菌肽抑菌作用检测过程的改进 为保证蚯蚓抗菌肽的抑菌活性得以准确表现出来，实验过程中要严格按照无菌操作的要求进行，且为了便于更好地观察蚯蚓抗菌肽的抑菌效果，要注意培养时间的控制，防止培养时间过长掩盖抑菌圈或培养时间过短看不出抑菌效果。为了更加精确地测量蚯蚓抗菌肽的抑菌活性，可采用考马斯亮蓝法来测得分离出的蛋白的含量，从而进一步确定蚯蚓抗菌肽的最小抑菌浓度。34蚯蚓抗菌肽的应用徐
17、国珍在蚯蚓抗菌肽对植物病原菌抑菌效果的研究中发现蚯蚓抗菌肽对病原真菌的抑菌效果很好，对小麦纹枯真菌、小麦赤霉真菌、棉花疫霉真菌、冬瓜枯萎真菌、均能产生较好的抑菌效果7。由于蚯蚓抗菌肽对植物病原菌具有很好的抑菌效果，所以将其应用于果蔬的保鲜和储藏中也具有光明的前景。参考文献1杜明亮,李成会.蚯蚓抗菌肽研究进展N.唐山师范学院学报,2014,36（2）：4952.2柴晓杰,王丕武,徐维,等.抗菌肽的研究进展及数数前景J.中国饲料,2005,4:1517. 3王辉,杨桂文,吴敬涛,等.抗菌肽作数机制的研究进展J. 济南大学学报:自然科学版,2007,21(1):4852.4刘兵.蚯蚓抗菌肽提取春花及性质研究D.贵州大学,2008.5林少琴,余萍,瑞芳等.蚯蚓抗肿瘤成分研究J.海峡药学,2000,12（3）:59611.6郑津辉,王景安,宋丽.蚯蚓抗菌肽的抗菌活性及影响因素的研究J.食品科技,2009,34(7):188190.7徐国珍.蚯蚓抗菌肽的提取纯化及其对植物病原菌抑菌效果的初步研究D.中国农业大学.2002.7