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1、 小鼠microRNA-125b过表达载体构建目 录摘要1Abstract31 前言42 材料与方法52.1 材料52.2主要试剂与仪器52.2.1主要试剂52.2.2主要仪器52.3 方法62.3.1质粒提取62.3.2鼠尾基因组DNA提取62.3.3 PCR引物设计与合成72.3.4 PCR扩增72.3.5琼脂糖凝胶电泳检测72.3.6 DNA产物纯化及回收82.3.7酶切及鉴定82.3.8载体构建93 结果与分析94 讨论115 结论116 参考文献12致谢14 摘 要NPC1是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病，迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释。研究
2、发现miRNA对tau蛋白的调控和神经元存活至关重要，通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶来调节tau蛋白磷酸化水平。Tau蛋白过度磷酸化损伤神经细胞功能和结构，如过度磷酸化使Tau蛋白结合微管能力降低1，Tau蛋白在神经元内聚积导致神经元轴突转运障碍2、乙酰胆碱释放减少3、蛋白酶体活性抑制4-7，这些功能和结构的改变可能导致神经元呈慢性进行性变性构建miR-125b表达载体，从tau蛋白磷酸化调控的研究入手，系统地研究参与tau蛋白磷酸化调控的miR-125b的靶基因，阐释其中的分子作用机制，为tau蛋白异常病变引起的神经退行性疾病的研究与防治提供新的思路。 本实验目的：构建小鼠microRNA-
3、125b（miR-125b）过表达载体。方法：参考小鼠miR-125b前体序列的PCR扩增引物，重新设计限制性内切酶位点为Nhe I和EcoR I，PCR扩增，然后将目的片段和pcDNA3.1-EGFP质粒进行双酶切鉴定，使用T4 DNA连接酶进行连接，转化DH5感受态细胞，挑取重组阳性克隆，对重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。结果：菌液PCR筛选鉴定出正确的miR-125b过表达载体，测序分析证实克隆的基因序列正确。结论：成功构建小鼠miR-125b的真核表达载体，为进一步研究miR-125b在C1型尼曼-匹克病中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。关键词：micro
4、RNA-125b；pcDNA3.1-EGFP；过表达载体13Construction of microRNA-125b overexpression vector in mouseAbstract Objective To construct the microRNA-125b(miR-125b) overexpression vector in mouse. Methods PCR amplification primers of miR-125b precursor sequence referred to article, we redesigned restriction enzyme
5、s for Nhe I and EcoR I. After being confirmed by PCR amplification, the target fragment and pcDNA3.1-EGFP plasmid were identified by double digestion., and connected using T4 DNA ligase. Then, it was transformed in DH5 competent cells. Finally, the recombinant plasmid were picked, and identified by
6、double digestion, agarose gel electrophoresis and DNA sequencing. Results miR-125b precursor sequence was successfully inserted into pcDNA3.1-EGFP plasmid by identification of DNA sequencing. Conclusion The eukaryotic expression vector of mouse miR-125b has been successfully constructed, which provi
7、des a foundation for further studying the mechanism of tau phosphorylation regulated by miR-125b in Niemann-Pick type C1 disease.Key words: microRNA-125b, pcDNA3.1-EGFP, Overexpression vector学士学位论文一、前言microRNA（miRNA，微小RNA）是一类长约20-24个核苷酸的内源性非编码单链小分子RNA，进化上具有高度保守性，广泛存在于真核生物中。成熟miRNA能够与靶基因3UTR以完全互补或不完全
8、互补的形式结合，诱导靶mRNA降解或抑制蛋白翻译，导致相应蛋白质合成缺失或减少，从而在转录水平、转录后水平、表观遗传水平等调控基因表达，参与生命过程中一系列的重要进程1。到目前为止，在人类和小鼠中分别发现超过1000和750种miRNA，其中一些主要在大脑中表达2-4，人类有接近1/3的基因受到miRNA的调控5。近年来的大量研究表明，miRNA的异常表达广泛参与了肿瘤、心血管疾病和糖尿病等重大疾病的发生与发展。同时，miRNA也参与了神经系统生长发育和生理功能的调控，其表达异常与神经退行性疾病的发生发展相关6。C1型尼曼-匹克病（Niemann-Pick disease type C1, N
9、PC1）是一种以溶酶体内脂质异常沉积为特征的中枢神经系统退行性疾病，迄今为止对NPC1的发病机制仍得不到合理的解释7,8。研究表明，tau蛋白和A（Amyloid beta，-淀粉样蛋白）在神经退行性病变中紧密联系，存在协同作用。tau蛋白在调节轴突运输功能的同时，亦参与A的致病机制，加剧A导致的神经元毒性、微管丢失、神经炎症变化等，进而导致神经变性和学习记忆障碍，揭示tau蛋白在神经元细胞变性的发生发展中起重要作用9,10。目前，虽然对tau蛋白参与神经退行性疾病的具体机理尚不明确，但已证实，抑制神经元tau蛋白过度磷酸化可以有效缓解神经退行性病变的发生和发展11。miRNA对tau蛋白磷酸
10、化的调控和神经元存活至关重要，通过调节蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的表达来调控tau蛋白磷酸化水平。miR-125b在阿尔茨海默病（Alzheimers disease, AD）中的发病机理是促进tau蛋白过度磷酸化。miR-125b超表达会引起tau蛋白过度磷酸化，分别上调蛋白激酶p35、cdk5和p44/42-MAPK和下调蛋白磷酸酯酶DUSP6、PPP1CA及抗凋亡因子Bcl-W的表达。抑制蛋白磷酸酯酶的表达会导致tau蛋白过度磷酸化，超表达PPP1CA和Bcl-W会阻止miR-125b引起的过度磷酸化，证实蛋白磷酸酯酶可以调节miR-125b对tau蛋白的影响。然而，抑制神经元中miR-12
11、5b的表达会降低tau蛋白过度磷酸化和蛋白激酶活性。另外，在小鼠海马内注射miR-125b会损害联想学习以及下调DUSP6、PPP1CA和Bcl-W表达，并增强tau蛋白过度磷酸化12。本研究构建了小鼠miR-125b的真核过表达载体，为进一步研究miR-125b在C1型尼曼-匹克病中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。二、材料与方法2.1 材料BALB/c小鼠、大肠杆菌DH5感受态细胞、pcDNA3.1-EGFP质粒均由实验室保存。2.2主要试剂与仪器2.2.1主要试剂PurePlasmid Mini Kit、2Es Taq MsterMix（康为世纪）、DNA Fragment P
12、urification kit（TaKaRa）、10quick cut Buffer、10quick cut Green Buffer、QuickCutTM Nhe I、QuickCutTM EcoR I、ddH2O、10T4 DNA Ligase、10T4 DNA Ligase Buffer、LB液体培养基、LB固体培养基、DNA Marker 2000bp、水合氯醛、琼脂糖、EB。2.2.2主要仪器本研究所用主要仪器的名称和生产厂家见表1。表1 主要实验仪器仪器生产厂家96孔梯度PCR仪ABI公司水浴锅北京光明医疗仪器有限公司高压灭菌锅上海申安医疗器械场恒温摇菌摇床江苏海门其林医用仪器厂台
13、式高速冷冻离心机SIGMANanodrop 2000分光光度计Thermo单人双面净化作台苏州净化设备有限公司电子天平上海精天电子电泳仪北京市六一仪器厂凝胶成像系统Uvitec公司10l微量移液枪Eppendorf100l微量移液枪Eppendorf1000l微量移液枪Eppendorf电热恒温培养箱北京中兴伟业仪器有限公司气浴恒温振荡器上海比朗仪器有限公司低温恒温槽上海平轩科学仪器有限公司2.3 方法2.3.1质粒提取1、将3ml的pcDNA3.1-EGFP菌液加入到1.5ml离心管中，6000rpm离心5min，弃上清。2、向沉淀中加入250l Buffer P1（已加入RNase A），
14、悬浮沉淀。3、向离心管中加入250l Buffer P2，缓慢的上下颠倒混匀，直到溶液变得清亮粘稠。4、其后加入350l Buffer N3，温和的上下颠倒，直至出现白色絮状沉淀后，12000rpm离心15min。5、离心后的产物弃上清，移入已装收集管的吸附柱中12000rpm离心1min，弃废液。随后加入500l Buffer PB 12000rpm离心1min，再加入750l Buffer PW12000rpm离心1min，弃废液，室温晾干，吸附柱至于新的离心管中，向膜上加入100l Buffer EB，放置3min 12000rpm离心1min。6、1%的胶进行电泳。2.3.2鼠尾基因组
15、DNA提取1、取5mm鼠尾切成小块置于1.5ml离心管中，加入180l Buffer GTL。2、向离心管中加入20l Proteinase K，振荡使样品彻底混匀。3、向离心管中加入200l BufferGL，振荡充分混匀，加入200l无水乙醇，振荡充分混匀。4、将上一步溶液全部加入已放入Collection Tube的Spin Column DM中，8000rpm离心1min，弃废液。5、向Spin Column DM中加入500l已加入无水乙醇的Buffer GW1，8000rpm离心1min，弃废液。6、向Spin Column DM中加入500l已加入无水乙醇的Buffer GW2，
16、14000rpm离心1min，弃废液。7、12000rpm离心1min，置于室温放置数分钟彻底晾干吸附材料中残余的BufferGW2。8、将吸附柱转入一个新的离心管中，向吸附膜的中间悬空加入200l灭菌水。9、室温放置5min，8000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。2.3.3 PCR引物设计与合成 参考小鼠miR-125b慢病毒过表达载体构建的引物13，重新设计限制性内切酶位点为Nhe I和EcoR I，引入保护碱基。引物序列为：Forward，5-GT GCTAGC ACT GGA CCA CCT GTT TGC-3。Reverse，5-CG GAATTC AAG GGT GTA
17、 TTA CCA TCA CTT C-3（划线部分为酶切位点），送到金唯智公司合成。2.3.4 PCR扩增1、反应体系：2Es Taq MsterMix 12.5lddH2O 9.5l上游引物 1l下游引物 1lDNA模板 1lTotal 25l2、反应条件：预变性：95oC 10min 变 性：95oC 30s退 火：64oC 30s延 伸：72o 30s终延伸：72oC 10min 2.3.5琼脂糖凝胶电泳检测配置1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增的PCR产物。1、溶胶：称取0.45g琼脂糖，加入25.5ml的1TAE电泳缓冲液，将三角瓶放入微波炉内加热溶解。冷却到60C加入EB，轻轻摇晃混匀
18、。2、制胶：水平放置凝胶托盘，放入梳子形成加样孔，将琼脂糖溶液倒入，室温下完全凝结。取下梳子，把凝胶放在有电泳缓冲液的电泳槽内。3、加样：将混合好上样缓冲液的DNA样品按顺序加入DOA加样孔内，最后加上2000bp的DNA marker。4、电泳：盖上电泳槽盖，接好电极插头。电泳条件：120V，30min。5、成像：取出凝胶放到凝胶成像系统中进行观察和照相。2.3.6 DNA产物纯化及回收1、将100l的DB Buffer加入到PCR反应产物中。2、将与DB Buffer 混合均匀的溶液置于已放入Collection Tube的Spin Column，12000rpm离心1min，弃上清。3、
19、再向其中加入500l Rinse A，12000rpm离心1min，弃上清。4、然后向管中加入700l Rinse B，12000rpm 离心1min，弃上清后再离心1min。5、将Spin Column置于新的1.5ml的新离心管中，向膜上加入25l的灭菌水后静置2min，12000rpm离心1min，进行洗脱DNA。2.3.7酶切及鉴定1、质粒酶切，37C，10min质粒 1l10quickcut Buffer 2.5l10quickcut Green Buffer 2.5lQuickCutTM Nhe I 1lQuickCutTM EcoR I 1lddH2O 17l2、电泳鉴定同2.3
20、.5。3、目的基因酶切，37C，10minDNA 20l10quickcut Buffer 3l10quickcut Green Buffer 3lQuickCutTM Nhe I 1lQuickCutTM EcoR I 1lddH2O 2l4、电泳鉴定同2.3.5。2.3.8载体构建1、连接，16C，过夜10T4 DNA Ligase 1l10T4 DNA Ligase Buffer 1lpcDNA3.1-EGFP质粒 2lmiR-125b 6l2、转化，16C，过夜50l DH5感受态细胞于冰浴中，把10l连接产物加到感受态细胞中，冰上裂解30min，42C水浴90s，取出冰上放置3min
21、，在超净工作台中加入900l LB培养基。3、涂板，37C，过夜在超净工作台中进行涂板，培养箱中倒置培养过夜。4、克隆菌液PCR 挑取单克隆，在画有九宫格的LB平板划线，1天后挑取单克隆做菌液PCR。提取质粒，酶切后电泳检测。5、测序鉴定阳性菌落对应的菌液送金唯智公司进行测序。3 结果与分析1、PCR产物扩增通过PCR从小鼠鼠尾基因组DNA中扩增到pre-mmu-miR-125b的序列，琼脂糖凝胶电泳检测可见在370bp处有明显的扩增条带（图1），与参考文献的产物大小一致，说明PCR扩增结果正确，可以进行下一步实验。图1 PCR扩增miR-125b序列电泳图2、质粒和PCR产物双酶切pcDNA
22、3.1-EGFP质粒和PCR产物经Nhe I和EcoR I双酶切，可见酶切后在6115bp处的质粒片段和370bp处的目的基因片段（图2和3）。图2 pcDNA3.1-EGFP质粒酶切后电泳图 图3 PCR产物酶切后电泳图3、菌液PCR产物双酶切鉴定阳性菌落对应的菌液PCR产物经Nhe I和EcoR I双酶切，可见酶切后在6115bp处的载体片段和370bp处的目的基因片段（图4）。图4 菌液PCR产物酶切后电泳图4、重组质粒的测序鉴定经酶切分析正确的克隆送金唯智公司测序，其结果与mirBase中的序列一致，证实已成功构建miR-125b的载体。4 讨论miRNA对神经退行性疾病（如AD、帕金
23、森症、亨廷顿病及癫痫等）的发生发展起到了非常重要的调控作用6。miRNA与靶基因mRNA构成了细胞内全方位多层次的基因表达调控网络系统，参与调节神经系统的发育过程及神经退行性疾病的发生。一个miRNA分子可以结合多个靶基因mRNA进而调控多种蛋白质的表达，同样，不同的miRNA分子可以结合同一个靶基因mRNA从而共同调控某种蛋白质的表达，最终实现其生物调节作用。NPC1患者脑中过度磷酸化的tau蛋白形成神经元纤维缠结在细胞内堆积14。正常脑中tau蛋白保持着磷酸化/去磷酸化的平衡，其磷酸化水平受到蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的共同调节。当蛋白激酶活性增高和/或磷酸酯酶活性降低时，tau蛋白出现过度磷
24、酸化的状态。tau蛋白被过度磷酸化后以配对螺旋丝结构的形式存在，失去对微管的稳定作用，阻碍微管的组装过程，造成相关神经递质的传输受阻，影响信号传递，降低轴突转运效率，最终导致神经元细胞变性死亡7。但是针对tau蛋白磷酸化的调控机制至今仍未阐释清楚，而对miRNA的研究可在一定程度上揭示tau蛋白参与神经退行性疾病的机制，并对NPC1的防治具有指导意义。miR-125b在AD中被证实能够促进tau蛋白的过度磷酸化12，由于NPC1与AD之间存在着相似的病理特征，包括胆固醇代谢异常、A聚集和tau蛋白病理学，揭示这两种神经退行性疾病存在某些相似的分子机制15。我们推测miR-125b在NPC1中同
25、样能够调控tau蛋白的磷酸化过程，通过成功合成pre-mmu-miR-125b的载体，有利于寻找新的调控和药物靶点，从而为诊断和治疗神经退行性疾病提供新思路。5 结论本研究成功构建小鼠miR-125b的真核表达载体，为进一步研究miR-125b在NPC1中调控tau蛋白磷酸化的作用机制奠定实验基础。 参考文献1 Filipowicz W, Bhattacharyya SN, Sonenberg N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight?J. Nature Rev
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33、iology of Disease, 2014, 72: 3747.致 谢在毕业论文完成的时候，我要感谢我的导师，她是一位特别认真负责和热情的老师，在我的毕业论文的撰写过程中，她都对我进行了认真的指导和详细的修改，从她的身上我也学到了很多，我要向指导老师表达我内心最崇高的敬意和最衷心的感谢！我也要感谢所有的代课老师和辅导员，在我大学四年的学习和生活过程中，这些老师给予了我很多的教导和很大的帮助，从他们身上我学到了很多做人的道理，将使我受益终生！我还要感谢我所在实验室的导师和师兄师姐，他们在试验期间给了我很多帮助，我在他们身上学到了很多知识，在他们的帮助和指导下，本实验才能顺利的完成，对他们表示衷心的感谢！最后，感谢我的家人和好友，他们的关爱和支持永远是我前进的最大动力，在任何时候，他们都给予我最大的鼓励和支持，我感谢他们！衷心的谢谢你们！