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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date黄土高原土壤微生物数量与酶活性的测定黄土高原土壤微生物数量与酶活性的测定黄土高原土壤微生物数量与酶活性的测定土壤是微生物栖息的最重要的生活环境之一，为微生物的生长提供了大量的营养元素和良好的碳源，氮源和能源。土壤微生物的数量和种类都十分丰富，主要种类有细菌，放线菌和真菌。土壤微生物作为地下食物网最初的分解者，是土壤有机质和土壤养分C,N,P,S等转化和循环的动力，并参
2、与土壤中有机质的分解，腐殖质的形成，土壤养分的转化循环等。土壤中也含有大量的酶类，土壤酶是一种生物催化剂，主要包括磷酸酶，蛋白酶，蔗糖酶，脲酶，过氧化氢酶，多酚氧化酶等，它能加速土壤中有机物质的化学反应。各种酶在土壤中的积累，是由于土壤微生物，土壤动物和植物根系的生命活动的结果。它们参与了许多重要的生物化学过程，腐殖质的合成和分解，有机化合物，高等植物和微生物残体的水解及其转化成为可利用的形态，以及氧化还原反应等，也就是说，它们参与了与土壤的发生和发育，以及与有效肥力的形成有关的诸过程的主要环节。本实验的目的就是要测定土壤中三类微生物（细菌，放线菌，真菌）的数量，以及六种酶（磷酸酶，蛋白酶，蔗
3、糖酶，脲酶，过氧化氢酶，多酚氧化酶）的活性。 目录第一章 土壤微生物数量的测定第一节 土壤细菌总数的测定第二节 土壤真菌总数的测定第三节 土壤放线菌总数的测定第二章 土壤酶活性的测定第一节 磷酸酶活性的测定第二节 蛋白酶活性的测定第三节 蔗糖酶活性的测定第四节 脲酶活性的测定第五节 过氧化氢酶活性的测定第六节 过分氧化酶活性的测定一窗体底端（一）培养基的制备： 测定微生物总量培养基:1.细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏 Beefextract 5.0g 蛋白胨 Peptone 10.0g NaCI 5.0g蒸馏水 1000m1 PH 7.2-7.4 2.放线菌培养基（高氏 1 号琼
4、脂培养基）可溶性淀粉 20gKNO3 1g K2HPO4 0.5gMgSO4 . 7H2O 0.5gNaCl 0.05g FeSO4.7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 注：配制时，先用少量冷水,将淀粉调成糊状,倒入少于所需水量的沸水中,在火 上加热,边搅拌边依次逐一溶化其他成分,溶化后,补足水分到1000ml,调pH。 另:倒平板之前,在溶化的培养基中加重铬酸钾溶液,每300mL培养基加3%重铬酸钾溶液1mL(l00ppm)。 3 .真菌培养基（马丁（Martin）-孟加拉红琼脂培养基）葡萄糖 10.0g MgSO4 .7H2O O.5g 蛋白胨 5.0g 孟加拉红 33.4mg （
5、或者每升加 1%溶液 3.3mL） K2HPO4 1g 蒸馏水 1000m1 PH 自然(4-5) 注：灭菌前加卡那霉素20g/ml，或者倒平板之前加链霉素。倒平板之前加乳酸，每100mL培养基加0.lmL。以上培养基皆加琼脂15g/L。测定功能菌所用培养基：1.亚硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基 A） 亚硝酸细菌培养基： (NH4)2SO4 2.0g NaH2PO4 0.25g MnSO44H2O 0.01g MgSO47H2O 0.03g K2HPO4 0.75g CaCO3 5.0g 蒸馏水 1000ml PH 7.2 注：CaCO3 最后加，不需要溶解，直接
6、调PH，培养基中有这个成分是为了缓冲pH。因为硝化细菌的生长会产生酸化效应，使得氢离子过剩，到了一定程度硝化作用将无法继续，所以要碱性物质平衡酸碱。下同。 2.硝酸细菌培养基（改良的斯蒂芬逊（Stephenson）培养基 B） 硝酸细菌培养基 ：NaH2PO4 0.25g K2HPO4 0.75gMgSO47H2O 0.03g MnSO44H2O 0.01gCaCO3 1.0g Na2CO3 1.0gNaNO2 1.0g 蒸馏水 1000ml PH 7.23.反硝化细菌培养基: 反硝化细菌培养基: 柠檬酸钠 5.0 gKNO3 2.0 g KH2PO4 1.0 g, K2HPO4 1.0 gM
7、gSO47H2O 0.2 g蒸馏水 1000 mlpH 值 7.27.51. 好气性自生固氮菌培养基（改良阿须贝(Ashby)无氮培养基） 苯甲酸钠 1.5 g K2HPO4 0.2 g MgSO47H2O 0.2 g NaCl 0.2 g CaSO42H2O 0.1 g PH 7.47.6 注：在培养基分装入试管时，每管加入一1cm 滤纸长条，要露出液面。 2. 氨氧化细菌培养基（蛋白胨氨化培养基） 氨氧化细菌培养基： K2HPO4 0.5 g KH2PO4 0.5 g, MgSO47H2O 0.5 g 蛋白胨 5.0 g 蒸馏水 1000ml PH 7.0-7.2 3. 好气性纤维素分解菌
8、培养基（依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基） 好气性纤维素分解菌培养基： KH2PO4 1.0 g FeCl36H2O 0.1 g MgSO47H2O 0.3 g CaCl26H2O 0.1 g NaCl 0. 1 g NaNO3 2.5 g pH 7.274 注：在培养基分装入试管时，每管加入一 1cm 滤纸长条，需露出液面。 (二)试剂的配制： 1.格里斯试剂（Griess Reagent）第一、第二液格里斯试剂（ 格里斯试剂 ）第一、第二液：第一液：将 0.5g 的对氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。 第二液：将 0.5g-萘
9、胺（-naphthylamine）加入50ml蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。 2. 纳氏试剂 甲液：将 20.0g 碘化汞和 10.0g 碘化钾溶于 100ml 蒸馏水中。 乙液：将 20.0g 氢氧化钾溶于 100ml 水中。 分别配制甲、乙二液，待冷却后混合，放置 2 天后使用。保存于棕色瓶中。取上清液使用，保存期三周，随着沉淀增加会影响测定结果。 3.二苯胺试剂： 溶 1.0g 无色的二苯胺（Diphenylamine）于 20ml 蒸馏水中，然后徐徐加入 100ml 浓硫酸（相对密度 1.84）中，保存于棕色瓶中。 （三）实验器材： 1
10、.仪器设备 4冰箱、立式自动电热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电热恒温水浴锅、 超净工作台、微量移液器、全温空气摇床、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。 2.器材准备 将 90ml 水装入 250ml 三角瓶中，并装有 15-20 个玻璃珠，灭菌。 将 9ml 水装入试管，灭菌。 试管架，1ml 无菌吸管，记号笔，白瓷比色板，接种环，酒精灯等。 （四）实验方法： 1.样品采集： 在靠近植株根系部, 去除表层 0-5cm 的表土，采集 520 cm 土壤剖面,多点采集, 混匀 后四分法取 1 kg, 装无菌塑料袋带回，4冰箱保存。 2.悬液制备: 称取 10g 土壤样品，放入盛有 90m
11、l 无菌水的三角瓶中，置于摇床上室温振荡 20min，使土样与水充分混合，将土壤中的微生物细胞充分分散，从土壤中分离出来。此为 10 土壤悬液，吸取 lml 此土壤悬液于 9ml 无菌水中，另用无菌吸管吹吸 3 次混匀，制成 10 土壤悬液。以此类推依次制成 10 、10 、10 、10 、10 、10 不同稀释度的土壤悬液。 3.土壤悬液稀释度选择: 细菌:10-410-6 放线菌：10-310-5 真菌：10-210-4 以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，二次重复。 亚硝酸细菌：10-310-6 硝酸细菌：10-310-6 反硝化细菌：10-410-7 好气性自生固氮菌：10-31
12、0-6 氨氧化细菌：10-510-8 好气性纤维素分解菌：10-210-5 以上采用最大或然法（MPN），分别设置四个浓度梯度，三次重复。 4.接种:液体培养基: 将六种功能菌培养基分装于试管中，每管 5ml，每个菌需培养基 12 支试管。按照纵 3 横 4 的方阵排列于试管架上，标签示之。 用 1ml 无菌吸管依次从低浓度到高浓度吸取土壤稀释液，放入各自对应编号的管中。 另取一管培养基接种 1ml 无菌水作为对照。 琼脂培养基： 将细菌、放线菌、真菌琼脂培养基采用混菌法进行接种，每个培养皿接种 lml 土壤稀释 液，二次重复。接种后，倒入 15-20ml 培养基迅速混匀。5.培养: 将所有试
13、管和平板置于 25-28黑暗条件下避光培养。培养时间由短到长分别为： 真菌：23d； 细菌：34d； 放线菌：57d。 氨氧化细菌：78d； 好气性自生固氮菌：78d； 亚硝酸细菌：1014d； 硝酸细菌：1014d； 反硝化细菌：1014d； 好气性纤维素分解菌：1014d； 6.结果观察: 亚硝酸细菌：取出培养液 5 滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、 第二液各两滴，如有亚硝酸盐存在，则呈红色。 硝酸细菌：取出培养液 5 滴于白瓷比色板上，加入格里斯试剂（Griess Reagent）第一、 第二液各两滴，如不呈红色，表示亚硝酸均已经完全消失。此时，另取培养液 5 滴于白瓷比 色板上，加二苯胺试剂 2 滴，如呈蓝色，则表示亚硝酸已经被氧化成硝酸，说明有硝酸细菌的存在。 反硝化细菌：加入格利斯亚硝酸试剂，观察颜色变化，确定正负反应。 好气性自生固氮菌： 观察试管培养液表面与滤纸接触处有无褐色或黏液状菌膜生成，或有无圆晕混浊出现。 氨氧化细菌： 取出培养液 5 滴于白瓷比色板上，加入纳氏试剂两滴， 如有氨氧化细菌存在，则呈棕色或褐色。 好气性纤维素分解菌：观察滤纸条是否成团，有无黄色或橘黄色菌斑出现及滤纸断裂情况。 土壤酶活性的测定-