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1、出芽短梗霉的诱变选育及丙二酸抗性筛选聚苹果酸高产菌摘要：目的：以出芽短梗霉（A.pullulans）AH2为出发菌株，经紫外诱变和丙二酸抗性筛选获得聚苹果酸高产菌株。方法：以AH2为起始菌种，经制霉菌素预处理，改变了出芽短梗霉细胞膜的通透性，再经紫外线诱变后进行丙二酸抗性筛选，然后经溴钾酚绿初筛，根据筛选培养基上的菌落形态特征以及HC值的大小，选出用于发酵的菌株，最后对发酵产生的聚苹果酸进行定量测定，筛选获得PMA高产菌株。结果：最终获得一株出芽短梗霉高产菌株丙5-5-4，其摇瓶发酵产量达到了20.80g/L，比出发菌株提高了6%,且高产特性稳定。结论：对丙二酸耐受的出芽短梗霉菌株可以高产聚苹
2、果酸，此种选育方法克服了随机筛选的盲目性，提高了菌种筛选的效率。关键词：聚苹果酸；PMA高产菌株；溴钾酚绿初筛；紫外诱变；丙二酸抗性筛选；出芽短梗霉Screening of high poly malic acid mutant of Aureobasidium pullulans against malonic acid of Succinodehydrogenase InhibitorAbstract ：Objective Starting from the AH2, by mutagenesis and screening to obtain poly malic acid produc
3、tion by Aureobasidium pullulans strains. Methods Taking AH2 as the starting strain, through nystatin pretreatment, changed by Aureobasidium cell membrane permeability, after UV mutagenesis of malonic acid resistance screening, and then by potassium and bromine phenol first green screen, according to
4、 the selection of culture based on the morphological characteristics of the colony and the HC value, select strains for fermentation. At the end of fermentation to produce poly malic acid was quantitatively determined and screened to obtain high-yield strains of PMA.Results Finally, a poly malic aci
5、d high yield strain 5-5-4 was obtained, its shake flask fermentation production reached 20.80g/L and the yield was increased by 6% compared with the starting strain AH2, and the yield was stable.Conclusion Aureobasidium pullulans of malonic acid tolerance can produce higher yield of poly malic acid
6、by fermentation.This method overcame the blindness of random screening, and improve the efficiency of screening.Key words：Poly malic acid; PMA strain; potassium bromide phenol green screening; UV mutagenesis; screening of malonic acid resistance; Aureobasidium pullulans第1章 前言1.1出芽短梗霉 出芽短梗霉（Aureobaci
7、dium pullulans）又称为“出芽苗霉”、“黑酵母”及“短梗霉”等，是一种半知菌类短梗霉，是类酵母真菌，它归属于半知菌门、丛梗孢目、短梗霉菌属具有酵母样和真菌菌丝体两种形态，这两种菌体形态受培养基成分、培养条件等因素的影响，是可以相互转变的。它在遗传上具有不稳定性，可以形成很多种变种，菌落最初有粘獨状，呈脏白色，很快转变为黄色，之后变为深绿色，最后为黑色，菌落边缘呈现辖射状，菌落的质地开始较为粘稠，最后变得坚硬Lin Y et al.Aureobasidium pullulans batch cultivations based on a factorial design for im
8、provingthe production and molecular weight of exopolysaccharides J,Process Biochemistry ,2007:820-827.。出芽短梗霉能产生很多种代谢产物，比如胞外多聚糖、酶类、抗菌素、聚苹果酸等。1.2 聚苹果酸的性质、结构、作用 聚苹果酸( Poly-malic acid，PMA) 是一种可完全生物降解且拥有高度生物相容性的水溶性高分子聚酯，PMA 具有良好的水溶性、易代谢性、可化学衍生性和生物安全性等特点而受到研究者的重视。 聚苹果酸有 、等3种结构，其中-PMA 在自然界广泛存在，用途也最为广泛，微生物发
9、酵所得均为型戈进杰.生物降解高分子材料及应用M.北京:化学工业出版社，2002.1-472.。苹果酸和聚苹果酸的结构如图1所示丁锐,李光吉.生物高分子聚苹果酸及其衍生物的合成与应用前景J.高分子通报,2005，17（2）：47-48.。图1 苹果酸与3种聚苹果酸的结构Fig.1 Structure of malic acid and poly (malic acid)s 聚苹果酸可降解生成苹果酸单体,其中L-苹果酸是生物体内三羧酸循环(TCA)的中间体,可参与代谢活动而被生物体吸收。此外,对聚苹果酸的侧链-COOH进行修饰或改性,引入功能基团或药物分子,从而提高药效和降低毒性。聚苹果酸的诸多优
10、点,使其在药物载体和生物材料等领域获得重要的应用,在诸如手术缝合线、药物控制释放体系、组织工程支架材料及食品包装材料等方面有着广阔的应用前景靳挺,李宁慧,方彦文,厉望,施亚芳,武玉学,尚龙安.生物医用高分子材料聚苹果酸的生物合成及其代谢途径研究J浙江大学宁波理工学院,2011.。1.3 聚苹果酸的合成现状聚苹果酸的生产方法主要分为微生物发酵法与化学合成法，化学合成法多以 -烷氧羰基-丙内酯为单体，在引发剂的条件下，通过开环聚合得到，成本相对较高余文兵，周华，韦萍.生物降解材料聚苹果酸的合成方法及应用进展J.化工进展，2004,23（10）：1086-1090.。化学合成法得到的产物分子量低,约
11、为24kDa,不具备实际的应用价值；且催化剂有毒性,副产物较多,产物分离较困难并且合成步骤冗长,提纯工艺复杂,收率低(20),合成成本很高,严重制约了其规模化生产。与化学合成法相比,生物合成法得到的-聚苹果酸分子量高,可达200760kDa；所需的原料简单易得,反应条件温和,产物较纯,近年来受到普遍的重视；但目前存在聚苹果酸的发酵产量低的缺点,距离聚苹果酸工业化生产的要求还有较大差距。现知能合成PMA的菌株主要有：短梗霉（Aureobasidium sp）、黏菌（Physarum polycephalum ）和出芽短梗（Aureobasidium pullulans）靳挺,武玉学,陈真,赵龙煜
12、.出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的研究J.中国食品学报,2012,10:125-130.。而有研究者表明短梗霉菌生产 PMA的能力较强Cao W, Luo J, Zhao J, et al. Intensification of -poly (L-malic acid) production by Aureobasidium pullulans ipe-1 in the late exponential growth phase J. Journal of Wndustrial Microbiology & Biotechnology, 2012, 39(7): 1073-1080.。目前普遍认为
13、微生物发酵积累PMA 是以 L-苹果酸为前体。刘双江等 Liu S J, Steinbuechel. Production of poly (malic acid) from different carbon sources and its regulation in Aureobasidium pullulans J. Biotechnology Letters, 1997, 19(1): 11-14 提出 Aureobasidium pullulans 合成 PMA 的途径与多头绒泡菌 Physarum polycephalum 相似，在两种真菌中，PMA 通过三羧酸循环和乙醛酸途径合成，
14、其中乙醛酸途径作为PMA合成的替代途径。程若东等程若东,王浩,周华,等.出芽短梗霉积累聚苹果酸途径及调控研究J.化工学报,2012,63(11):3639-3644 通过添加代谢抑制剂推断出芽短梗霉积累PMA与TCA循环和乙醛酸途径有关。近年来，相关研究者主要研究聚苹果酸产生菌出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)生物合成聚苹果酸的基本规律,重点研究生物合成中存在的关键问题如高产菌株的选育、发酵动力学及聚苹果酸合成代谢途径等,以提高聚苹果酸的产量,相关的工作具有重要的科学意义和研究价值,可为实现生物合成聚苹果酸的产业化提供理论依据和技术支持。本文主要是通过琥珀酸脱氢酶抑制
15、剂丙二酸结合紫外诱变选育聚苹果酸高产菌株。1.4 出芽短梗霉菌种的选育 针对我国聚苹果酸不能形成工业化问题，出芽短梗霉的菌种选育主要希望能得到产酸量较高的菌株。基因突变是诱变育种的理论基础，而基因突变主要是碱基点突变和染色体畸变这两大类。诱变育种是用物理因素、化学试剂处理动植物或微生物细胞，使其基因突变的频率提高，然后选择适当的方法从变异群体中选择符合人们要求的单株个体，进而培养成新品种的方法。诱变育种是在杂交育种之后发展起来的一种新方法。物理诱变剂主要有紫外线，射线，射线，快中子，激光，微波，离子束等。其中紫外线是一种非电离辐射，具有很好的诱变效果，而且使用使用紫外诱变的特点是比较方便和安全
16、。碱基对紫外波段的光都具有很强的吸收能力，而其吸收高峰值为260nm。在紫外照射过程中，分子大量并强烈的吸收紫外线，形成嘧啶二聚体，也就是两个相邻的嘧啶进行共价连接，进而形成嘧啶二聚体，嘧啶二聚体的形成致使氢键作用减弱，同时使双链结构发生扭曲，导致碱基之间无法形成正常配对，从而有可能引起突变，甚至死亡。另外二聚体的形成，使双链无法正常解开，因而引起复制和转录的异常。总之紫外线处理后可以引起碱基的缺失、移码突变、颠换或转换徐志平. 复合诱变出芽短梗霉选育普鲁兰高产菌株D.湖北大学,2012.。 因此，本文主要是对出芽短梗霉进行紫外诱变，另加筛选压力丙二酸，选育聚苹果酸高产菌株。第2章 正文材料与
17、方法2.1 仪器与材料2.1.1 实验菌株 实验所用菌株为出芽短梗霉AH2突变株（诱变剂：ARTP等离子），由本实验室经在平板上划线冷冻于冰箱。2.1.2 培养基1. 种子培养基：（100mL） 用于出芽短梗霉的接种培养葡萄糖 6g ，硝酸铵0.2g ，硫酸锌 0.01g ，硫酸镁 0.01g ，氯化钾0.05g ，玉米浆 0.1g ，磷酸二氢钾 0.01g 。115灭菌30 min。2. YPD培养基：（100mL） 用于菌株的活化葡萄糖 2g ，酵母粉 1g ，琼脂 2g，蛋白胨 2g。115灭菌30 min 。3. 发酵前种子培养基：（100mL） 用于菌株发酵前培养葡萄糖 6g ，硝酸
18、铵 0.2g ，硫酸锌 0.01g ，硫酸镁 0.01g ，氯化钾 0.05g ，玉米浆 0.1g ，磷酸二氢钾 0.01g 。以上成分混合调PH5.7后，加入碳酸钙0.6g/瓶(按每瓶加30mL培养基计算），在115灭菌30 min。4. 发酵培养基：（100mL） 用于菌株发酵葡萄糖 9g ，硝酸铵 0.2g ，硫酸锌0.01g ，硫酸镁 0.01g ，氯化钾 0.05g ，玉米浆 0.05g ，磷酸二氢钾0.01g ，柠檬酸 0.1g 。以上成分混合调PH4.0后，加入碳酸钙0.9g/瓶(按每瓶加30mL培养基计算），在115灭菌30 min。5. 初筛培养基(0.02%溴甲酚绿培养基，
19、100mL）： 用于初步筛选出产聚苹果酸量大的菌株葡萄糖 3g ，硝酸铵 0.2g ，磷酸二氢钾 0.01g ，氯化钾0.05g ，硫酸镁 0.02g ，琼脂 2g 。115灭菌30 min 。溴甲酚绿溶液（0.01g/mL）单独灭菌，灭菌后按0.02%加入三角瓶中。2.1.3 试剂葡萄糖，硝酸铵（重庆吉元化学有限公司），硫酸锌(重庆博艺化学试剂厂),硫酸镁（成都科龙化工试剂厂），氯化钾（成都科龙化工试剂厂），玉米浆 ，磷酸二氢钾（成都科龙化工试剂厂），蛋白胨（生物制药股份有限公司），琼脂粉（成都科龙化工试剂厂）,碳酸钙，柠檬酸 ，溴甲酚绿 (成都科龙化工试剂厂)，制霉菌素。2.1.4 溶液丙
20、二酸溶液 0.05g/mL 溴甲酚绿溶液0.01g/mL2.1.5 仪器及设备1.电子分析天平 JA003A2.T8新世纪型紫外可见分光光度计 购于北京普析通用仪器有限责任公司3.DELTA 320 pH计4.电热鼓风干燥箱 购于重庆市永生实验仪器厂5.FRESTECH 电冰箱6.湘仪离心机 TGL-16M高速台式冷冻离心机7.生化培养箱 购于重庆市永生实验仪器厂8.LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器9.HH-S2二孔数显水浴 购于郑州长城科工贸有限公司10.AIRTECH 超净台 购于苏州安泰空气技术有限责任公司11.摇床 购于重庆仪器有限公司）12.HPLC（日本日立，L-3130高
21、压泵、L-2200自动进样器、L-2455紫外检测器）13.ZHWY-2102深孔板恒温培养振荡器 购于上海智城分析仪器制造有限公司14.QHZ-DA 全温大容量振荡培养箱2.2 实验方法2.2.1 出芽短梗霉的种子液培养 从平板培养基上刮取一环活化后的AH2，接到灭过菌的装有50mL种子培养液的250mL的三角瓶（一般需要加入几颗玻璃珠）中，置于摇床28 ,180rpm培养。长到约24h，培养基变得比较浑浊，而且瓶壁上有丝状悬浮物，取下三角瓶，用紫外可见分光光度计测定种子液的OD值，进而判断菌种生长情况。一般OD=1.0大概是出芽短梗霉处于对数期的时候，生长最为旺盛。所以一般取此时的菌种进行
22、诱变等操作。2.2.2 出芽短梗霉AH2的紫外诱变致死率曲线的制作取OD=1.0的菌液经已灭菌的垫有两层滤纸的漏斗过滤后，用无菌水稀释至OD=0.1。将OD=0.1的菌液稀释125倍后加入经灭菌后的平板培养皿中，并加入灭菌的搅拌子，在电磁搅拌器搅拌作用下，15W的紫外灯管30cm处靳建忠,王慧娟,孔维甲,葛海涛,张宁,李炳学.紫外诱变选育出芽短梗霉高产普鲁兰糖白化突变菌株J.食品科学,2011,11:187-191.紫外均匀照射0、2、3、5、7、10、11、12、13min。将紫外照射后的菌液在暗室红光下按每个平板100uL菌液进行涂布。涂布后的平板需要放在避光，25左右的环境中培养2d后观
23、察结果，结果如表1所示。其中，致死率(%)=（对照组菌落总数-处理后菌落总数）/对照组菌落总数100%孟国庆.头孢菌素C高产菌株选育及发酵特性研究D.山东轻工业学院,2011.（注意：由于紫外线照射过的细胞易发生光修复作用，培养时放在暗处或用黑纸、黑布包裹进行避光培养）表1 紫外照射时间与出芽短梗霉致死率的关系Table 1 Relationship between UV irradiation time and the death rate of Aureobasidium pullulans紫外时间（min）致死率（%）00224.5346.9569.3778.41088.61193.41
24、2951398.3图2 紫外诱变时间对出芽短梗霉菌致死率的影响Fig.2 UV mutagenesis time lethal effect on the rate of Aureobasidium pullulans 据孙波等孙波,徐宁.以玉米粉为原料L-乳酸高产菌株的选育和产酸条件的研究J.食品工业, 2009(5):6-8.研究报道：在紫外诱变效应中，正突变常常出现在致死率较高的剂量。一般致死率以80%90%或者更低剂量有利于正突变株的产生，诱变效果较好。由图2可知，诱变处理5、7、10min时致死率大约在80%90%及稍低范围内，所以初步选择5min、7min、10min三个时间为本试
25、验最佳诱变剂量。2.2.3 抗性筛选（1） 原理 紫外诱变作为最常用、最有效的诱变方法，由于它诱变频率高且不易发生回复突变的优点，一直受到众多微生物工作者的青睐。但是，由于基因突变具有不定向性，诱变选得的突变株往往各具优势但很难得到综合酶系优良的菌株，从而使得诱变育种工作量大，而又具有很大的不确定因素。因此，如何快速高效地进行微生物遗传育种，一直是微生物研究工作中的重点周其洋.酱油生产菌菌种改良及其工艺的研究D.江南大学,2009.。由于丙二酸是琥珀酸的结构类似物，是琥珀酸脱氢酶强有力的竞争性抑制物，而琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸氧化成为延胡索酸进而促进三羧酸循环的酶，该酶被抑制，则三羧酸循环被阻
26、断，造成线粒体内的柠檬酸大量积累，进而反馈抑制柠檬酸合酶的活性，使得草酰乙酸积累，则苹果酸脱氢产生草酰乙酸的平衡向生成苹果酸的方向移动，最终使得苹果酸大量积累，由于L-苹果酸是聚苹果酸的前体物，所以苹果酸的积累会使聚苹果酸相应的积累。因此可以利用此性质将丙二酸作为筛选压力，选育出丙二酸耐受菌株，避免了传统随机筛选的盲目性，大大提高了筛选效率孟国庆,赵林,戴秀君,李越中,李世旭,刘新利.头孢菌素C高产菌株的推理选育J.中国抗生素杂志,2011,12:889-894+951. 。（2）丙二酸的敏感性实验 配制0.5g/mL的丙二酸溶液，共做0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L六个浓
27、度梯度，并据此配制YPD平板。将种子培养液按每板100uL涂布于平板上，2d后观察菌落抑菌圈大小，结果如图3所示。（注：（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）对应的丙二酸浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8g/L） 图3 出芽短梗霉对丙二酸的敏感性实验Fig. 3 sensitivity experiment of Aureobasidium pullulans of malonic acid 由图3可知，随着丙二酸浓度的增加，菌落的大小发生了比较大的变化。由（2）和对照（1）相比，菌落直径变小了10倍不止，抑菌圈相应的呈变大趋势，说明出芽短梗霉对丙二酸很敏感。当丙二
28、酸浓度到达0.1g/L时，菌落直径继续减小，再继续提高丙二酸的浓度，菌落直径和抑菌圈直径几乎没有明显的变化。由此，确定0.1g/L作为丙二酸的最佳筛选浓度。2.2.4 紫外诱变结合丙二酸抗性筛选 由紫外诱变的致死率曲线和丙二酸的敏感性实验确定的最佳条件为：0.1g/L丙二酸+紫外5min，紫外7min，紫外10min 步骤：取OD=1.0（培养24h）的菌液经垫有两层滤纸的漏斗过滤后，稀释至OD=0.1，取5mL OD=0.1的菌液加入2uL的制霉菌素（微量的制霉菌素与真菌细胞膜上的异甾醇相结合，导致原生质体膜破坏，膜通透性改变，提高了出芽短梗霉对诱变因素的敏感性王昆蓉,谢云,张洪兰,冉启平,
29、俞岩青.制霉菌素预处理选育麦考酚酸高产菌株J.中国抗生素杂志,2013,10:741-743.，有利于紫外诱变和丙二酸筛选）后，充分振摇15-20min。将菌液稀释125倍后加入经灭菌后的平板培养皿中，并加入灭菌的搅拌子，在电磁搅拌器搅拌作用下，15W的紫外灯管30cm处紫外均匀照射0、2、3、5、7、10、11、12、13min，用移液枪分别取至四个离心管中备用。将紫外照射5、10、7min后的菌液涂布于0.1g/L的丙二酸平板培养基上，紫外照射0min的菌液涂布于未经丙二酸处理的平板培养基上，涂布在暗室红光下进行。涂布后的平板需要放在避光，25左右的环境中培养3d后观察结果。 2.2.5
30、初筛（1）原理 溴甲酚绿作为最常用的酸碱指示剂，其颜色变化能灵敏的指示溶液中酸度的变化。由图1可知，聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体，相互之间通过酯键连接成的聚合物，分子中含有多个羧基，故具有较强的酸性，可以使溴甲酚绿发生颜色变化,所以可以将溴甲酚绿加入培养基中构建初筛平板培养基王光耀.高产率生产乳酸拟干酪乳杆菌的高通量选育方法建立及应用D.上海：华东理工大学，2013.，随着菌株产酸的增多，培养基的颜色也将由蓝向黄变化。菌株产酸越多则培养基变色越快，便可在不检测培养液中聚苹果酸酸含量的情况下，通过初筛平板培养基颜色和变色圈直径与菌落直径比值初步判断菌株的产酸的多寡。因为同条件下培养，在相同培养时
31、间内，培养基颜色越黄菌株产酸越多，也就意味着产酸速率越高，所以本方法可以用来初筛产酸速率高的突变株。虽然本方法不具有特异性，但却可以满足高通量初筛的要求。（2)方法 用灭菌牙签将2.2.4中得到的的菌株随机挑选尽可能多的在0.02%溴甲酚绿的初筛平板培养基上，每个平板上划9个区域，每个区域挑一株菌，25恒温培养2d，观察结果并用量程为15cm的较薄的直尺分别测黄色变色圈的直径长度和相应的菌落的直径长度，再计算两者比值，记为HC值，如图4和表2所示，变色圈黄色越深，黄色的圈直径与菌落直径比值（HC值）越大，表明该孔的菌株产酸较快，选取菌落的黄色圈直径与菌落直径比值（HC值）相对较大的转接到YPD
32、培养基上，以待进一步验证王光耀,刘慧兰,王永红,储炬,张嗣良. 高通量选育高速率产L-乳酸拟干酪乳杆菌J.食品工业,2013,10:152-154.。（3）结果如图4（注：（1）、（2）、（3）、(4)、(5)表示从丙二酸浓度0.1g/L+紫外5min平板上挑选的菌株、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)表示从丙二酸浓度为0.1g/L+紫外10min平板上挑选的菌株、(11)、(12)表示从丙二酸浓度0.1g/L+紫外7min平板上挑选的菌株，由于实验组丙二酸浓度均为0.1g/L，所以以下均分别简写为“丙5”、“丙10”、“丙7”）图4 溴甲酚绿初筛图 Fig. 4 bromocresol
33、 green screen picture表2 溴甲酚绿初筛变色圈直径与菌落直径比值（HC值）Table 2 bromocresol green screen color ring diameter and colony diameter ratio (HC value)HC值平板编号123456789丙513.10特小2.002.502.002.00较小较小2.6722.852.502.412.602.33很小-2.332.713极小1.75很小1.75-1.501.25-2.704-1.50-1.522.002.00极小2.675-2.003.103.002.602.402.001.502
34、.67丙101-1.502.001.503.75俩菌落俩菌落2.673.002-很小2.002.001.67很小很小2.3331.501.252.803.202.601.402.402.402.6741.502.673.202.60俩菌落2.402.002.003.0053.603.502.002.002.802.803.403.003.60丙71-2.50很小很小1.332.331.501.803.002-2.002.502.802.003.602.50-3.00注:9号表示对照AH2所对应的HC值。表中“-”表示没有点上菌落的位置或者点了没有长出的。标黑的是HC值比对照HC值大或者与对照H
35、C值接近的菌株。编号是指每个平板上9株菌各自对应的编号。 由图4和表2可知，丙5-1-1、丙5-2-1、丙5-5-3、丙5-5-4、丙10-3-3、丙10-3-4、丙10-4-3、丙10-5-1、丙10-5-2和丙7-2-6（命名是按照先行后列的顺序编写）这10株菌株的变色圈黄色较同条件下对照菌株AH2黄色深或者接近，且HC值比同条件下的对照菌株AH2的HC值大或者接近，由于HC值越大，说明相同时间内产酸量越多，即产聚苹果酸的速度越快，因此将这10株菌继续用于复筛过程。2.2.6 深孔培养板复筛 虽经溴甲酚绿初筛，获得了10株HC值相对对照组稍大或者接近的菌株，但是为节省成本和降低实验操作复杂
36、程度，实现高通量筛选，首先在48深孔培养板上进行了复筛刘慧兰.产乳酸耐高温凝结芽孢杆菌的诱变及进化选育D.华东理工大学,2014.。（1） 菌种活化 将经初筛得到的10株菌株和出发菌株AH2以及原始菌株F2转接到YPD培养基中，于恒温培养箱25培养2d，以待下一步使用。（2） 发酵前种子培养 将配好的种子培养基按每孔2mL，每株菌做2个平行，将活化后的12株菌株分别接种到相应孔中。置于摇床上25、200r/min振荡培养2d。（3） 发酵 从每瓶种子培养基中取出种子培养液500uL，加入已灭菌的装有2mL发酵培养基中，每株菌做三个平行，置于摇床上25,200r/min振荡培养4d，取下深孔培养
37、板，测定发酵液中的聚苹果酸含量（测量方法具体见2.3）。（4） 按2.3.4处理方法得图5结果：（稀释倍数为8倍）图5 不同诱变株深孔板复筛发酵液中的聚苹果酸产量Fig. 5 The yield of poly- malic acid in the fermentation broth of deep hole plate with different mutation 测得苹果酸含量仅有丙5-5-4、丙10-5-1、丙10-5-2、丙7-2-6四株菌的苹果酸产量略高于出发菌株AH2的产苹果酸量，其中，丙5-5-4的苹果酸含量明显高于出发菌AH2，产量相对AH2提高了25.7%，对F2提高了3
38、4.7%，猜想此株可能是高产株。为避免遗漏一切可能的高产菌，所以将此四株菌用于下一步进行摇瓶发酵验证。2.2.7 摇瓶复筛（1）菌种活化 将深孔板复筛得到的聚苹果酸含量较对照大的四株菌株和出发菌株AH2以及原始菌株F2共6株菌株转接到YPD培养基中，于恒温培养箱25培养2d，以待下一步使用。（2）发酵前种子培养 将菌株分别接种到已灭菌的装有30mL种子培养基的摇瓶中，每株菌做2个平行，置于摇床上25,200r/min振荡培养2d。（3）发酵 从每瓶种子培养基中取出种子培养液3mL，加入已灭菌的装有30ml发酵培养基中，每株菌做三个平行，置于摇床上25,200r/min振荡培养4d，取下摇瓶，测
39、定苹果酸含量。2.2.8 摇瓶发酵液中PMA的定量检测 HPLC测定聚苹果酸含量的原理昝占全.生物质资源发酵生产药用高分子材料聚苹果酸的研究D.西南大学,2013.：将聚苹果酸用硫酸水解，检测苹果酸含量，计算聚苹果酸含量。聚苹果酸含量=苹果酸含量*134/152。L-苹果酸的含量测定标准曲线为y = 54.265x - 4.219 R2 = 0.9996，其中纵坐标为峰面积，横坐标表示聚苹果酸浓度。（1）发酵液的前处理 取复筛目标菌株的发酵液8mL经 12 000 r /min 离心 5 min 后，各取上清液1mL，加入等体积的 2 mol /L H2SO4 ，90 水解 9 h，用于后续的
40、聚苹果酸检测。（2）发酵液上清水解液的稀释 经H2SO4水解后的水解液，在10000r/min 离心6min，取上清500uL，加入到加有2mL纯水的离心管中。（3）进样 用0.22um微孔滤膜过滤入进样瓶中，选用HPLC自动进样进行进样，以每个样品跑样40min。（4）数据处理 根据L-苹果酸的含量测定标准曲线为y = 54.265x - 4.219 R2 = 0.9996处理得如图表3和图6结果：（稀释倍数为10倍）表3 出芽短梗霉摇瓶发酵水解液中聚苹果酸含量表Table 3 Aureobasidium pullulans shake flask fermentation table of
41、 content of poly-malic acid in thehydrolysate编号峰面积聚苹果酸含量（g/L）聚苹果酸含量 平均值（g/L）1F21459.413.9617.052F21858.517.833F22017.519.371AH22074.119.9119.612AH21832.517.573AH22222.921.361丙5-5-42210.221.2420.802丙5-5-42171.120.863丙5-5-42115.720.321丙10-5-12230.521.4317.412丙10-5-11726.316.543丙10-5-11729.116.571丙10-5
42、-21781.417.0718.182丙10-5-22069.419.873丙10-5-21596.715.291丙7-2-62069.319.8717.412丙7-2-61619.015.503丙7-2-61760.116.87图6 不同诱变株摇瓶发酵液中聚苹果酸含量平均值图Fig.6 average value of poly-malic acid content in shake flask fermentation broth of different mutant strain2.3 结果与讨论2.3.1 结果 经摇瓶复筛，结果如图6和表3所示，在4株用于复筛的突变株中，只有丙5-5
43、-4的聚苹果酸产量20.80g/L比出发菌株的产量19.61g/L提高了6% ，较野生菌株F2提高了22.02%，较大程度的提高了出芽短梗霉的聚苹果酸产量，证明了猜想。其余三株突变株聚苹果酸产量虽不及AH2，但相对于F2原始菌都有一定程度的提高。2.3.2 讨论本实验中，最初在深孔板复筛后得到的四株高产菌丙5-5-4、丙10-5-1、丙10-5-2、丙7-2-6中，经摇瓶发酵验证，只得到了一株丙5-5-4高产菌。由于丙二酸的浓度均为0.1g/L，说明本实验中紫外诱变的最佳剂量是30w 15cm照射5min。紫外照射5min时致死率为69.3%，符合致死率在80%-90%及稍低剂量。照射7min
44、和10min的致死率为78.4%、88.6%，存活率仅为21.6%、11.4%，在丙二酸筛选条件下此时的致死率有可能过高，导致菌株存活率较低。一般情况下，在存活率约 30.0% 的诱变条件下，诱变效果较好，适于筛选突变菌株吴天祥,陈岩.复合诱变曲霉选育高产壳聚糖菌株及培养及优化J.中国酿造, 2009(3): 43-4。深孔板复筛与摇瓶复筛结果有一定的差距，原因可能是深孔板因为是高通量筛选，虽然操作简便，但由于每孔只有2mL培养基，操作过程比较小的差错可能就会造成比较大的误差，所以结果与摇瓶结果相比有很大差距。 本实验利用菌种选育的两方面，即菌种诱变和目的菌的筛选。筛选方面，首先是丙二酸的压力
45、筛选，丙二酸筛选聚苹果酸高产菌是通过影响菌株琥珀酸脱氢酶的活性进而的TCA过程来影响代谢产物苹果酸的产量,从而影响聚苹果酸的产量。再经过溴甲酚绿变色圈法初筛，得到10株变色圈直径与菌落直径比值较出发菌大的菌株，而最后摇瓶结果显示只有一株聚苹果酸高产菌。原因可能是初筛整个过程都是人工操作，没有比较精准的检测方法，采用的是10cm的直尺，最小刻度为0.1cm，直接测直径的大小，其中存在很多偶然性因素影响读数，最终产生的误差比较大。而摇瓶发酵最后的结果是通过精密度比较高的HPLC获得，误差相对比较小，结果比较接近事实产量。第3章 结论 通过本实验，主要得到以下结论： （1）经紫外诱变、丙二酸筛选获得了聚苹果酸高产突变株丙5-5-4，摇瓶发酵产量达20.80g/L，比出发菌株AH2提高了6%，比野生菌提高了22.02%，为工业化生产打下了基础。此种选育方法证明了丙二酸耐受性菌株确实能够定向选育出聚苹果酸高产菌，克服了随机筛选的盲目性，提高了菌种筛选的效率。 （2）因出芽短梗霉是真菌，细胞壁比较厚，孢子对有害物质的耐受性强，对诱变剂不敏感，采用制霉菌素改变其细胞膜通透性的方法，提高出芽短梗霉对紫外线以及丙二酸的敏感性，有利于诱变筛选获得PMA高产菌株。 （3）丙二酸是琥珀酸脱氢酶强有力的竞争性抑制剂，而琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸氧化成为延胡索酸进而促进三羧酸循环的酶，通过向出芽短梗霉的培