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1、目录摘要1Abstract2第一章 绪论31.1研究背景31.2国内外研究现状及研究意义31.3 研究内容5第二章 Shewanella puterfaciens CN32及测试指标标线52.1 CN32菌准备52.1.1 收菌方法52.1.2测收菌后OD值62.1.3接菌62.2铁标线62.3菌体生长标准曲线72.4 SMP蛋白标准曲线8第三章 不同铁源及电材料对Fe(III)的还原效果的影响93.1引言93.2材料与方法103.2.1 培养基准备103.2.2 实验材料113.2.3仪器123.3 实验设计123.3.1 数据处理133.3.2 测定周期133.4实验分析方法133.4.1
2、分析指标133.4.2 Fe(II)浓度133.4.3黄素143.5 结果与讨论143.5.1 针铁矿及电材料对Fe(III)的还原效果的影响143.5.1.1 溶解态Fe(II)143.5.2 NTA-Fe及电材料对Fe(III)的还原效果的影响193.5.2.1 溶解态Fe(II)193.6 本章小结24第四章 不同条件下细菌分泌蛋白的差异264.1引言264.2材料与方法264.2.1 培养基准备264.2.2 实验材料274.2.3仪器274.3 实验设计284.3.1 数据处理294.3.2 测定周期294.4 实验分析294.4.1分析指标294.4.2菌体生长情况294.4.3分
3、泌蛋白浓度304.5结果与讨论304.5.1 菌体生长304.5.2 细菌分泌蛋白32第五章结论与展望345.1结论345.2展望34第六章 致谢35不同铁源及导电材料的添加对Shewanlla puterfaciens CN32铁还原过程的影响摘 要：异化铁还原菌还原Fe(III)是铁循环及能量流动的重要环节，在微生物的氧化还原反应中，铁氧化物充当电子载体，能够有效的加快微生物对有机物的降解。有研究表明通过补充外源微量元素可以有效提高厌氧微生物活性，铁元素便是外来元素之一。在自然界中有很多细菌可以通过还原矿物中的高价铁以获取能量，其中奥奈达湖希瓦氏菌Shewanella oneidensis
4、是研究最多的异化铁还原菌之一。所以本文以Shewanella puterfaciens CN32为微生物，研究的内容包括：1.考察了添加导电材料对Fe(III)还原效果的影响，结果显示：以针铁矿为铁源时，添加石墨及CNTs对Fe(III)还原有抑制作用。以NTA-Fe为铁源时，添加石墨及CNTs能够刺激Fe(III)还原。2.考察了不同铁源下对Fe(III)还原效果的影响，实验结果表明游离态NTA-Fe的Fe(III)还原效果较固定态针铁矿的还原效果好。3.考察了不同的条件下细菌分泌蛋白的差异，结果表明添加石墨对分泌蛋白有促进作用，添加CNTs对分泌蛋白有抑制作用。关键词：Shewanella
5、 puterfaciens CN32；Fe(III)还原；不同铁源；导电材料；分泌蛋白The impact of adding different types of iron and conductive material on Shewanlla puterfaciens CN32 iron reductionAbstract：Bacteria reduction of iron oxide Fe (III) is an important part of iron circulation and energy flow in the oxidation-reduction reaction
6、 of microorganisms, the iron oxide acts as an electron carrier, can effectively accelerate the microbial degradation of organic matter.it is shown that by supplementing exogenous trace elements can effectively improve the anaerobic microbial activity, iron is one of foreign elements.There are many b
7、acteria by reduction of ferric minerals for energy in nature, where the Oneida Lake Shewanella Shewanella oneidensis is one of the most studied alienation iron-reducing bacteria.So this paper use Shewanella putrefaciens CN32 as microorganisms, the study include:1.The effect of adding a conductive ma
8、terial to Fe (III) reduction effect, the results show: the goethite iron source, adding graphite and CNTs to Fe (III) reduction of inhibition. In NTA-Fe is iron source, adding graphite and CNTs can stimulate the Fe (III) reduction.2.The effects of different iron sources under on Fe (III) reduction e
9、ffect, the experimental results show that the free state NTA-Fe of Fe (III) reduction effect than the reduction effect of fixed goethite good.3.The effects of differences in bacterial secreted proteins under different conditions, the results showed that addition of graphite can promote secretion of
10、the protein, adding CNTs to inhibit the secretion of the protein.Keywords:Shewanella puterfaciens CN32;Fe (III) reduction;secreted proteins; different iron source; a conductive material第一章 绪论1.1研究背景 在土壤、沉积物及浅埋藏的环境中，存在着丰富的铁的氧化物（如水铁矿、赤铁矿及针铁矿等）1,2，这些铁的氧化物是地球表层中最重要的铁资源。控制了地表系统中的Fe(II)-Fe(III)的氧化还原就等于掌握了
11、铁循环过程及能量流动的重要环节3.4，其中含铁矿物的微生物氧化-还原作用越来越受到人们的关注4，5 。部分异养厌氧型微生物在进行呼吸作用的同时还可以通过还原 Fe(III)来获得能量，这种铁的异化还原能力在许多生物、地球及化学循环中都起着举足轻重作用6-10，也能显著影响重金属污染的生物修复、金属腐蚀的控制及生物质能转化等11-14 。所以，Fe(III)的还原是铁的生物、地球及化学循环过程的重要环节。 目前已经发现了自然界中有许多细菌可以通过还原矿物中的高价铁以获取能量 4 ，其中奥奈达湖希瓦氏菌Shewanella oneidensis是研究最多的异化铁还原菌之一15-19 。Shewan
12、ella属常见于土壤、沉积物、地表水和地下水，为革兰氏阴性异化金属还原菌，能利用氧气、高价金属以及变价无机盐类作为终端电子受体，获取生长所需能量 20-23。从细菌与针铁矿反应过程的研究中显示，在厌氧环境下 Shewanella puterfaciens在针铁矿表面的吸附远强于有氧条件，并且由于细菌表面的还原酶多，可促进电子由细菌向矿物的表面有效转移 24,25。对比针铁矿与 +3 价游离铁离子的微生物还原作用，发现细菌易于直接还原游离态的Fe 3+ 离子，而结晶态铁矿物的溶解还原则相对比较困难 26。有研究表明在蓝藻厌氧发酵产沼气是资源化的过程中,通过补充外源微量元素可以有效提高厌氧微生物活
13、性,铁元素便是外来元素之一28。亚铁子能够有效的提高产甲烷菌酶的活性,而且铁氧化物是自然界中一种广泛存在且价廉易得的矿物,可以作为一种外源添加物在蓝藻的厌氧发酵中使用。Kato S 研究认为,在微生物的氧化还原反应中,铁氧化物充当电子载体,能够有效的加快微生物对有机物的降解29。1.2国内外研究现状及研究意义在上世纪70年代国外就已经开始了有关异化Fe(III)还原的研究，研究Fe(III)还原菌的分类、分离、分子机制及极端环境条件下异化Fe(III)还原菌，在研究生命起源及进化中起到重要的意义，异化Fe(III)还原菌应用于放射性核素、石油等碳氢化合物和垃圾渗滤液污染的地下水的原位修复，异化
14、Fe(III)还原菌还在产生微生物燃料电池方面作了大量的原创性工作。虽然目前对Fe(III)还原菌的研究已经做了大量的工作，但是国内在这方面的研究还比较少；国外大多数是关注于海洋、湖泊和沼泽等生态系统的研究，对蓝藻中的Fe(III)还原菌研究却比较少。Fe(III)还原菌的形态多异，营养类型多样。但是目前还没有获得能够为Fe(III) 还原菌通用的功能性基因，这就极大的阻碍了Fe(III) 还原菌在生态系统中的原位研究；如果能够借助于日益先进的生物分子学技术找到功能性基因，这将会大大促进Fe(III)还原菌的研究和其在生物修复方面的应用。我国拥有大面积的湖泊资源，但很多湖泊及河流都受到了蓝藻的
15、污染，所以十分有必要深入了解蓝藻中的Fe(III)还原菌的多样性；且蓝藻是湖泊河流中的一种微生物，是由于大量氮、磷等营养元素的排入而产生的蓝藻爆发。Fe(III)还原菌既在生态系统中既是碳循环的驱动者，同时又是氮循环的参与者。Fe(III)还原菌如Geobacter除了参与还原铁氧化物外，还参与了NO3 、依赖型铁Fe(III)还原和Fe(III) - NH+4 很可能也具有与氧化还原耦合的关联。此外，Fe(III)还原菌(Geobacter)还具有固氮酶，而固氮菌（Clostridia）同时也是一种异化Fe(III)还原菌。总之，Fe(III)还原菌与C、N代谢有着密切的联系。深入的研究微生
16、物介导的C-Fe-N耦合的机制，探究Fe(III)还原菌在生态系统中 C、N 代谢的生态意义将会推动整个生态系统的生物地球的化学循环30。Fe(III)还原菌在生物修复中有巨大的潜力，研究Fe(III)还原菌在生物修复中的应用,对开发出既经济又高效的修复途径在人类生态系统的健康发展方面具有重要时代意义。除了通过添加单一的电子供体来刺激Fe(III)还原菌的生长来提高污染物的去除率之外，添加导电材料在Fe(III)还原菌生物修复中的作用机制和应用同时也需要进一步研究。在自然界之中, Fe(III)能够被生物还原成 Fe2+。不管Fe3+是以溶解态还是固态的形式存在。微生物细胞与固体矿物之间的电子
17、传递是控制岩石圈能量交换的基本过程27。Fe(III)不可能与外周胞质蛋白直接结合,因为它们是以难溶的固体形式存在于细胞表面之外,并且在大多数条件下不能通过细胞外膜。但是有一些还原铁氧化物的细菌可以做到这一点,它们通过将相关细胞色素置于细胞外膜外表面使得其接触到氧化物表面从而实现传递电子27。还有其他的机制包括生物合成具有电子受体和电子供体特性的水溶性有机化合物充当电子梭促进电子传递31。2008 年,Von Canstein 等32，报道还原金属的希瓦氏菌属可以分泌核黄素(维生素B2)和黄素单核甘酸(FMN)充当电子梭促进结晶度低的 Fe3+氧化物的还原。1.3 研究内容 本文采用希瓦氏奥奈
18、达菌（Shewanella puterfaciens CN32，简称 CN-32）CN-32 为研究菌株和人工合成的针铁矿、人工配置的Fe-NTA为两种不同的电子受体，并在不同电子受体的培养基中加入导电材料CNTs或石墨。构建营养充足的、pH 为中性的厌氧环境体系，研究了不同铁源及导电材料的添加对Shewanella puterfaciens CN32铁还原过程的影响研究，讨论了不同铁源及导电材料的添加对Fe(III)的还原效果的影响及不同条件下细菌分泌蛋白的差异。第二章 Shewanella puterfaciens CN32及测试指标标线2.1 CN32菌准备 所用菌种为奥奈达湖希瓦氏菌S
19、hewanella puterfaciens CN32由中国海洋微生物菌种保藏管理中心提供(MCCC，编号1A01706)。培养基：好氧培养基为LB培养基参考分子克隆实验指南33，pH 7.2。CN-32菌株的活化、传代和培养均在好养培养基中进行，使用 LB 培养基（10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母膏，10 g/L NaCl）于室温下活化三代。然后进行洗菌和收菌。2.1.1 收菌方法 燃烧的酒精灯边，12000 rpm,5 min,洗涤3次。需要的仪器：预先灭菌:50mL压盖式离心管（保鲜袋装），1mL移液枪，200mL无机培养基；需提前准备但无需灭菌：冰盒（取冰用），废液缸，酒精灯，打
20、火机。 收菌及洗菌时重悬洗菌的操作方法：（操作必须在酒精灯边，并且每次使用都要用火焰轻燎，保证无菌）离心后弃去上清夜，燃烧的酒精灯边，菌体沉淀中用灭菌过的1mL抢打入5mL无机培养基，反复抽吸直至分散完全，将离心管盖及管口在火焰边轻晃后盖紧离心管进行离心，第3次洗菌可以将菌液用枪合并在一起后进行。2.1.2测收菌后OD值 取0.1mL浓缩菌，稀释至10mL后用紫外分光光度计测定，波长为600nm.2.1.3接菌将所需浓缩菌液按照收菌后的OD值算好，在无氧条件下，用1mL一次性针管取菌也注入灭好菌的厌氧瓶中。2.2铁标线试剂：（1）铁标准储备液：精确称量0.7020g硫酸亚铁铵(（NH4)2Fe
21、(SO4).6H2O ),溶于50mL的（1+1）硫酸中，转移至1000mL的容量瓶中，加水至标线，然后摇匀。此时溶液中每升100g铁。 （2）铁标准使用液：精确移取25mL铁标准储备液于100mL的容量瓶中，加水至标线，摇匀，此时溶液中每升25g铁。 （3）（1+3）盐酸。 （4）10%盐酸羟胺溶液。 （5）缓冲溶液：40g乙酸铵加入50mL冰乙酸最后用水稀释到100mL。 （6）0.5%邻菲啰啉（1,10-phenanthroline）水溶液，加入浓盐酸帮助于溶解。步骤：依次移取铁标准使用液0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0置于150锥形瓶中，加入蒸馏水至50mL，再加入
22、1mL的（1+3）盐酸，1mL10%盐酸羟胺溶液，之后加入1-2粒玻璃珠。加热煮沸至溶液剩15mL左右，冷却至室温，定量转移至50mL具塞比色管中。加入一小片刚果红试纸，滴加饱和乙酸钠溶液至试纸刚变红，加入5mL缓冲溶液，2mL0.5%邻菲啰啉，加水指标线，摇匀。显色15min后，用10mm比色皿，以水为对照，在510nm处测吸光度。测得的标线为： 表2.1 铁标线浓度(mg/L)吸光度00.08310.29420.50430.67940.86951.068 图2.1 铁标线2.3菌体生长标准曲线Bradford蛋白含量检测法标准曲线建立采用牛清蛋白（生工）为蛋白质标准物质，设置10、20、4
23、0、80、100及200mg/L等不同浓度。移取0.1mL 0.5mol/L NaOH 溶液加入0.9 mL 蛋白质标准物质，121 下加热20 min 裂解细胞。待充分冷却后，离心悬液（12000rpm,5min），去0.2 mL 上清夜与1 mL Bradfor试剂（生工）混合(1.5 mL离心管内)，利用分光光度计于595 nm 波段读取光度值。表2.2 菌体生长标线浓度(mg/L)吸光度00100.08200.142400.250800.4321000.524 图2.2菌体生长标线2.4 SMP蛋白标准曲线 Bradford蛋白含量检测法标准曲线建立采用牛清蛋白（生工）为蛋白质标准物质
24、，设置10、20、40、80、100及200mg/L等不同浓度。移去0.2 mL 上清夜与1 mL Bradfor试剂（生工）混合(1.5 mL离心管内)，利用分光光度计于595 nm 波段读取光度值。 表2.3 菌体分泌蛋白标线浓度(mg/L)吸光度00100.092200.154400.317800.5391000.621图2.3 SMP蛋白标线第三章 不同铁源及电材料对Fe(III)的还原效果的影响3.1引言 近年来Fe()还原在环境重要性越来越受到人们的关注。Fe()作为电子受体,通过异化型铁还原菌的异化作用,把Fe()还原成Fe(II),实现多种有机物的氧化。无论是固定态的Fe()还
25、是游离态的Fe()都可以被铁还原菌还原成Fe(II)，相比之下游离态的Fe()比固定态的Fe()被还原的效果要好些34。电子穿梭体（Electron shuttles）在胞外的Fe()还原中到重要作用，中性 pH 条件下，当环境中的Fe()是以不可溶的复合物形式存在时, 这些不可溶复合物中的 Fe()不易与菌体外膜直接接触。这样，从菌体外膜蛋白到不可溶复合物的Fe()的电子传递就必须要通过一可溶的中间体来实现，这一中间体通常被叫作电子穿梭体。电子穿梭体能够不断的从外膜蛋白接受电子，之后再把接受的电子传给Fe()复合物，从而实现Fe()的还原。3.2材料与方法 3.2.1 培养基准备 厌氧培养基
26、成分为：20mmol/L 乳酸钠（电子供体），0.46g/L NaCl， 0.255g/L (NH4)SO4，0.024g/L MgSO47H2O， 20mmol/L(4.766g/L) HEPES，5mL/L 微量元素储备液，其中添加NTA-Fe及水热合成针铁矿作为不同的电子受体，并在不同电子受体的培养基中加入1g/L 导电材料CNTs或石墨，调节初始pH为7.2，鼓氮气排净瓶内空气，然后用丁基胶塞密封后灭菌。配培养基时需要多配200 mL无机培养基，转入蓝盖试剂瓶，半盖瓶盖后灭菌，保存待洗菌用。培养基体积为100 mL，添加菌的OD值为0.5。不使用维生素，微量元素直接加到无机培养基中。培
27、养基配完后分装到厌氧瓶中，通N2 5分钟后封装，之后于121高压蒸汽灭菌，保存待用。微量元素储备液：表3.1 微量元素储备液组分Mineral Mix浓度（g/L）NTA1.5MgSO43.0MnSO4.2H2O0.5NaCl1.0FeSO4.7H2O0.1CaCl2.2H2OCoCl2.6H2O0.10.1ZnCl20.13CuSO4.5H2O0.01AlK(SO4).12H2O0.01H3BO30.01Na2MoO40.025NiCl2.6H2O0.024Na2WO4.2H2O0.0253.2.2 实验材料 菌株：奥奈达湖希瓦氏菌Shewanella puterfaciens CN32。
28、固定态铁源：人工合成的针铁矿。游离态铁源：Fe-NTA，根据Reed et al.( 2007)的方法制备35。导电材料：CNTs，325目球形石墨。3.2.3仪器表3.2 仪器仪器名称型号上海仪电科学仪器股份有限公司电子天平FA2004N上海市菁华紫外-可见分光光度计U-301Hitachi 公司立式压力蒸汽灭菌器LDZX-75KBS上海申安医疗器械厂高纯水机GREEN-10T南京易普易达科技发展有限公司冷冻离心机Neofuge 18RHeal Forc恒温培养箱THZ-90A上海一恒科技有限公司pH 计雷磁 PHS-3C上海仪电科学仪器股份有限公司3.3 实验设计 采用厌氧瓶为反应体系，体
29、积为100 mL 。实验用针铁矿、NTA-Fe两种铁源，不同铁源设置对照、石墨、CNTs三个实验组，每个实验组分别设置A、B反应体系。6个实验组，共需要12个厌氧瓶，厌氧瓶塞处用丁基胶塞塞住后再用瓶塞拧紧。将这6个实验组置于培养箱中，定期从反应体系中取一定量的混合溶液进行分析、测量。组成：表3.3 反应体系组成类别电子供体电子受体菌株添加剂针铁矿石墨物质乳酸钠S.Puterfaciens CN32NTA-FeCNTs 实验分组: 表3.4 实验分组实验分组StrainssubstrateFe(III)(20mM)Additives(1 g/L)gra-1Shewanella puterfaci
30、ens CN32乙酸钠goethitegraphiteCNT-1CNTscontrol-1gra-2NTA-FegraphiteCNT-2CNTscontrol-23.3.1 数据处理 实验中所测得的数据需要用Excel进行整理，然后运用Origin8绘制图表。3.3.2 测定周期 测定周期：12h，24h，36h，48h，60h，84h。3.4实验分析方法3.4.1分析指标 液相指标：核黄素、FMN、Fe(II)。 固相指标：HCl提取态Fe(II)。3.4.2 Fe(II)浓度离心1mL样品悬液（12000rpm,5min）。溶解态Fe(II)：取0.5mL上清液稀释，1mL稀释液 + 1
31、mL铁缓冲溶液 + 0.4邻菲罗啉，稀释至10mL，显色5-10min,利用分光光度计于510 nm 波段读取光度值。HCl可提取态Fe(II)：沉淀用20mL纯水重悬，取1mL悬液与1mL 1mol/L HCl混合，室温下静置5min，离心（12000rpm,5min），取1mL上清液 + 1mL铁缓冲溶液 + 0.4邻菲罗啉，稀释至10mL，显色5-10min,利用分光光度计于510 nm 波段读取光度值.3.4.3黄素 在给定的时间间隔内，从厌氧瓶中取出少量混合液，12000rpm,5分钟离心，之后过0.22m的滤膜。取100L过膜后的溶液注入到液相色谱中（LC-1100，Agilent
32、 Inc.,USA），该液相色谱配置C18columm(Waters Inc.,Ireland)。流动相由25%甲醇和75%醋酸铵（0.05M，去离子水配置，PH 7.0）组成，流量 0.8ml/min。黄素类物质由RF-10AXL荧光检测器（Shimadzu Co.,Japan）在激发波长420nm和发射波长525nm处检测。为了获得标准曲线，由基础培养基配置FMN和RBF（Sigma,Inc.,USA）标准液，标准溶液浓度为0.1到10M。样品中FMN和RBF的浓度通过与标准面积比较对应峰的积分面积测定。3.5 结果与讨论 3.5.1 针铁矿及电材料对Fe(III)的还原效果的影响3.5.
33、1.1 溶解态Fe(II)研究以针铁矿为铁源添加不同导电材料的实验组，从图3.1中可以看到溶解态的Fe(II)在对照组的浓度要高于石墨组及CNTs组，而石墨组的溶解态Fe(II)的浓度又要比CNTs的高一些。从中我们可以得出结论就是添加石墨和CNTs导电材料对溶解态Fe(II)的浓度溶出有抑制作用，相比之下，添加CNTs组对对溶解态Fe(II)的浓度溶出的抑制效果比石墨的抑制作用较强。在前24小时之内，对照组与石墨组中的溶解态Fe(II)的浓度增长较快，而CNTs组的增长速率较慢，24小时至60小时之间三个实验组的增长速率相差不大，之后CNTs组的溶解态Fe(II)的浓度的增长速度有所加快。从
34、图1中我们可以看到在60-84小时的时候，石墨组的溶解态Fe(II)浓度的增长速率是整个实验中增长速率最快的。图3.1溶解态Fe(III)浓度 3.5.1.2 HCl可提取态Fe(II)而从图3.2中可以看到HCl可提取态Fe(II)的浓度变化，相比较我们可以看出添加石墨组中的HCl可提取态Fe(II)的浓度要比对照、CNTs组的高。就HCl可提取态Fe(II)而言，我们可以得出结论就是：添加石墨对HCl可提取态Fe(II)的浓度有促进作用而添加CNTs对HCl可提取态Fe(II)的浓度有抑制作用，但促进效果不是很明显而添加CNTs对HCl可提取态Fe(II)的浓度的抑制效果却比较大。图中可以
35、看到石墨组及CNTs组的HCl可提取态Fe(II)的浓度一直呈现出增长的趋势，对照组的HCl可提取态Fe(II)的浓度整体呈现增长的趋势，但在48小时和84小时的时候浓度却出现了反常。到达实验结束，发现对照组合石墨组的HCl可提取态Fe(II)的浓度相差不多，为3.505mg/L与3.582mg/L。 图3.2 盐酸提取Fe(III)浓度 3.5.1.3 总Fe(II)的浓度为了更加方便的讨论Fe(III)的还原的效果，我把溶解态Fe(II)的浓度和HCl可提取态Fe(II)的浓度进行相加，得到了总Fe(II)的浓度。并绘制了图3.3（总铁浓度），从图3.3中我们可以从整体中看出添加石墨和CN
36、Ts对Fe(III)的还原都有一定的抑制作用，添加CNTs组从反应开始到反应结束，二价铁的浓度相对于对照组都要低。而添加石墨组在前24小时内对Fe(III)的还原效果与对照组的还原效果相差不大，24小时之后添加石墨的实验组才表现出对Fe(III)的还原的抑制作用。从图中我们可以看到在84小时的时候，石墨组的总铁浓度要高于对照组的总铁浓度，对于这个现象的出现，可以用上面所提到的图3.1中石墨组的溶解态Fe(II)的浓度相对于60小时的溶解态Fe(II)的浓度增长速率较大。及图3.2中对照组的HCl可提取态Fe(II)的浓度要低于60小时的HCl可提取态Fe(II)的浓度来解释。图3.3 总Fe(
37、III)浓度从针铁矿与导电材料的实验组可以看出：添加CNTs对实验一直是抑制作用，对照组的最高总Fe(II)的浓度为9.245mg/L。石墨组的最高总Fe(II)的浓度为7.826mg/L。CNTs组的最高总Fe(II)的浓度为6.381mg/L。 3.5.1.4 黄素、FMN及RBF 图3.4 RBF浓度图3.4为针铁矿为铁源的实验组的RBF的浓度，从图中可以看到，RBF的浓度在前12小时增长速率很大分别为。对照组中的RBF浓度在逐渐的增长，到反应结束到达最高浓度为0.219M。从12小时到60 小时增长速率较低，而从60小时到96小时速率突然增大。石墨组的RBF浓度从小时后开始下降，到达6
38、0小时后又突然增长。而CNTs组的RBF浓度也是从12小时后开始下降，但下降到达36小时后又开始缓慢上升，到达60小时后突然增长速率变大。石墨和CNTs的RBF最大浓度都是在12小时的，说明在前12小时添加导电材料的实验组分泌的RBF量最大，添加这两种材料的细菌分泌RBF有一定的抑制作用。 图3.5 FMN浓度图3.5是以针铁矿为铁源的实验组中的FMN浓度的变化，从图中的整体趋势可以看出添加了石墨和CNTs这两种导电材料之后对FMN的分泌有一定的抑制作用。前12小时，三个实验中的FMN浓度都增长的比较快。同样的对照组中的FMN浓度还是在缓慢的增长，到反应结束最高浓度到达1.7095M。石墨组在
39、12小时之后开始下降，开始下降缓慢，之后突然下降的很快，但到达60小时到96小时内FMN的浓度突然增长的很快，反应结束FMN的浓度到达最大并且超过了对照组的最大浓度，为1.8585M。而添加CNTs组的FMN浓度从12小时的最大浓度后就开始下降，然后又开始上升，但上升的趋势不大。为了更好的讨论细菌分泌的黄素类物质，我把RBF和FMN相加起来，得到了图3.6。图3.6 flavins浓度图3.6为两种黄素类物质的加和浓度，从flavins中可以看到添加了石墨及CNTs这两种导电材料后对flavins的分泌有一定的抑制作用，前12小时，三个实验中的flavins浓度都增长的比较快。对照组中的fla
40、vins浓度还是在缓慢的增长，到96小时到达最高浓度为1.9285M。石墨组在12小时之后开始下降，开始下降缓慢，之后突然下降的很快，但到达60小时到96小时内flavins的浓度突然增长的很快，反应结束flavins的浓度到达最大并且超过了对照组的最大浓度，为2.024M。而添加CNTs组的FMN浓度从12小时的最大浓度后就开始下降，然后从36小时后开始上升，但上升的趋势不大。 3.5.1.5讨论对于针铁矿为铁源的实验组，添加石墨及CNTs对Fe(III)的还原效果有一定的抑制作用，而CNTs的抑制作用比石墨的作用要大。针铁矿是固态铁源，在体系中Fe(III）从电子供体中通过细菌传递电子而接
41、受电子，从而实现Fe(III)还原，还原成的Fe(II)在反应体系中是以溶解态Fe(II)和盐酸可提取态Fe(II)的形式存在。到停止实验的时候，对照组、石墨组及CNTs组中的浓度为最高浓度，各为9.245mg/L、7.826mg/L、6.381mg/L，对照组中总Fe(II)浓度比石墨组多18.1%，对照组比CNTs组总Fe(II)浓度多44.9%。针铁矿的还原是属于生物过程，同时也担任着电子受体的作用。导电材料在胞外不可溶的 Fe(III)还原过程中起着重要作用，环境中的三价铁一般是以不可溶的形态存在，这样的三价铁不易与菌体外膜直接接触，电子穿梭（Electron shuttler）等物质
42、的作用是要不断的从外膜蛋白接受电子，再把接受的电子传给三价铁的复合物，从而实现三价铁的还原36。Shewanella puterfaciens CN32可以分泌两种黄素类物质，FMN和RBF，在本实验中可以看出黄素类物质主要是以FMN。有实验研究分泌黄素类物质对针铁矿还原的贡献，他们的测试条件下检测下得到RBF为主要的物质34。FMN和RBF的浓度与细菌生长的速率有关，从菌体生长曲线中看出：前12细菌增长速率大，所以黄素类物质在前12小时前增长的速率也比较大。实验中RBF在对照、石墨、CNTs中的最大浓度各位0.219M、0.1675M、0.0665M，FMN在对照、石墨及CNTs中的最大浓度
43、则为1.7095M、1.8585M、0.331M。FMN在对照、石墨及CNTs在黄素类物质中个占了88.6%、91.8%、83.3%。大多数希瓦氏菌属可以分泌黄素类物质作为electron shuttler，而electron shuttler可能帮助一些电子供体将电子转移到细胞，所以黄素类物质在希瓦氏菌的胞外电子传递过程中具有不可或缺的作用，Fe(III）还原与黄素的功能密切相关34。从flavins中的浓度可以看出添加CNTs对黄素分泌有抑制作用，从而使添加CNTs在针铁矿为铁源时对Fe(III）还原效果也有抑制作用。3.5.2 NTA-Fe及电材料对Fe(III)的还原效果的影响 3.5
44、.2.1 溶解态Fe(II)研究以NTA-Fe为铁源添加不同导电材料的实验组，我们从图3.7中可以看到溶解态Fe(II)的浓度在石墨组及CNTs组的浓度都要高于对照组，而CNTs组溶解态Fe(II)的浓度要比石墨组的溶解态的Fe(II)的浓度高一些。单从溶解态的Fe(II)浓度中我们可以得出结论就是添加石墨和CNTs导电材料对溶解态的Fe(II)浓度有促进作用。由于NTA-Fe是游离态的，所以12小时测得的溶解态的Fe(II)的浓度要高，之后逐渐转化为HCl可提取态Fe(II)。在24小时、36小时及60小时中我们可以看到溶解态的Fe(II)的浓度都低于12小时及48小时的浓度，这是都是因为溶
45、解态Fe(II)与HCl可提取态Fe(II)相互转换的结果，所以溶解态Fe(II)的浓度就呈现出上升随后下降的趋势。图3.7 溶解态Fe(III)浓度 3.5.2.2 HCl可提取态Fe(II)而从图3.8中可以看到HCl可提取态Fe(II)的浓度变化，相比较我们可以看出添加CNTs组中的HCl可提取态Fe(II)的浓度要比对照、CNTs组的高，单从HCl可提取态Fe(II)来看，我们可以得出结论就是：添加CNTs对HCl可提取态Fe(II)有促进作用。从图3.8中我们可以看到在48小时的时候，CNTs组的HCl可提取态Fe(II)的浓度达到最大浓度，最高浓度为4.945mg/L。而石墨与对照
46、组达到最大浓度的时间为60小时，最高浓度分别为3.828mg/L、3.977mg/L。由此可见添加CNTs能够促进反应的进行，加快了反应的速率。在前24小时内，石墨组的HCl可提取态Fe(II)的浓度要比对照组的要高，之后对照组的HCl可提取态Fe(II)的浓度反而超过了石墨组的浓度。由于NTA-Fe为溶液，所以在测HCl可提取态Fe(II)的时候有可能存在部分的溶解态Fe(II)以及实验上的误差，因此可能存在图3.5中对照组108小时的HCl可提取态Fe(II)突然比石墨组的浓度低。图3.8 盐酸提取态Fe(III)浓度 3.5.2.3 总Fe(II)的浓度为了方便的讨论Fe(III)的还原的效果，我同样把溶解态Fe(II)的浓度和HCl可提取态Fe(II)的浓度进行了整理，得到总Fe(II)的浓度。并绘制了图3.9（总铁浓度）。总铁浓度的变化毫无规