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1、我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物第二章第二章 基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础第一节第一节 限制性内切酶限制性内切酶第二节第二节 DNA DNA连接酶连接酶第三节第三节 DNA DNA聚合酶和反转录酶聚合酶和反转录酶第四节第四节 DNA DNA修饰酶修饰酶第五节第五节 外切核酸酶外切核酸酶第六节第六节 单链内切核酸酶单链内切核酸酶第七节第七节 RNA RNA酶酶我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个
2、活的生物核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。基本概念及其生物功能基本概念及其生物功能特异水解断裂特异水解断裂RNA分子，分子，核糖核酸酶（核糖核酸酶（RNase）特异水解断裂特异水解断裂DNA分子，分子，脱氧核糖核酸酶（脱氧核糖核酸酶（DNase）非专一性酶，底物或者为非专一性酶，底物或者为DNA或者为或者为RNA从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶外切核酸酶从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内内切核酸酶切核酸酶 按水解断裂核酸
3、分子的方式按水解断裂核酸分子的方式: 根据作用的核酸底物不同根据作用的核酸底物不同:我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物基因工程的操作，是在分子水平上的基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶操作，是依赖一些酶( (如限制性核酸内切酶，如限制性核酸内切酶，连接酶，连接酶，DNADNA聚合酶等聚合酶等) )作为工具对基因进行作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为酶称之为“工具酶工具酶”。 工具酶工具酶 我吓了一跳，蝎子是多么
4、丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1 1、限制、限制- -修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个
5、活的生物 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。 限制性核酸内切酶概念限制性核酸内切酶概念我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2. 2. 性质性质内切酶内切酶主要来源于主要来源于原核生物原核生物即在核酸分子链的即在核酸分子链的内部内部制造切口的酶。制造切口的酶。形成形成5 5-P-P和和3 3-OH-OH末端末端 自我保护作用自我保护作用3. 3.
6、功能功能细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/MR/M体系）体系）1. 1. 来源来源任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物大肠杆菌大肠杆菌B B大肠杆菌大肠杆菌K Kphage (B)phage (B)EOP=10EOP=10-4-4（限制作用限制作用）EOP=10EOP=10-4-4（限制作用限制作用）EOP=1EOP=1（修饰作用修饰作用）修饰的修饰的phage (K)phage (K) 人们发现侵
7、染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的的寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰现象简称（简称（R/MR/M体系体系）。）。 细菌的细菌的R/MR/M体系类似体系类似于免疫系统，能辨别自身的于免疫系统，能辨别自身的DNADNA与外来的与外来的DNADNA，并能使后者降解掉。，并能使后者降解掉。 寄主的限制与修饰现象寄主的限制与修饰现象E.O.P E.O.P 成斑率成斑率efficiency of platingefficiency of platingEOP=1EOP=1我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它
8、放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外源外源DNADNA进行分进行分解，解，切成小片断。切成小片断。（1 1）限制（）限制（RestrictionRestriction） 限制作用限制作用: :实际就是限制性内切酶降解外源实际就是限制性内切酶降解外源DNADNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。维护宿主遗传稳定的保护机制。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 细菌自身的细菌自身的DNADNA碱
9、基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化修饰所保甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2 2）修饰（）修饰（ModificationModification） Dam Dam甲基化酶甲基化酶( (DNA Adenine MethylaseDNA Adenine Methylase) )G GA ATC TC 腺嘌呤腺嘌呤N6N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm Dcm甲基化酶甲基化酶( (DNA cytosine MethylaseDNA cytosine Methylase) )C CC CAGGAGG或或C CC CTGGTGG序列在第二个序列
10、在第二个C C上上C C5 5位置上位置上引入甲基引入甲基 修饰作用修饰作用: :宿主细胞通过甲基化作用达到识别自宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。身遗传物质和外来遗传物质的目的。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物（3 3）限制与修饰系统相关的三个基因）限制与修饰系统相关的三个基因 hsd hsd R: R: 编码限制性内切酶编码
11、限制性内切酶 hsd hsd M: M: 编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶 hsd hsd S: S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别这类酶能识别DNADNA分子上的特定位点，并将双分子上的特定位点，并将双链链DNADNA切断切断这类酶使这类酶使DNADNA分子特定位点上的碱基甲基化，分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰即起修饰 DNA DNA的作用。的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实
12、我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2.2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K K株，株，B B株株 中，中， 1 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNADNA和噬菌体和噬菌体DNADNA特异性保护特异性保护. . 2 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点-（修饰）（修饰）1.1.大肠杆菌宿主细胞大肠杆菌宿主细胞 K K株，株，B B 株株 ，有各自的限制和，有各自的限制和修饰系统。修饰系统。限制和修饰作用的分子机制限制和修饰作用的分子机制我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它
13、放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物3. 3. 外来外来DNADNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解解 - -（限制）（限制）4. 4. 由于降解不完全，外来少数由于降解不完全，外来少数DNADNA分子在宿主细胞中分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。来却不被降解。 5 5接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。菌修饰的标记，丧失在原
14、宿主细胞中的存活能力。基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体基因工程中，应采用缺少限制作用的菌株作为受体。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1 1、限制、限制- -修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸
15、内切酶我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物19731973年年H.O SmithH.O Smith和和D. NathansD. Nathans提议的命名系统，提议的命名系统，命名原则如下：命名原则如下：限制性内切酶的命名限制性内切酶的命名 用用属名属名的第一个字母和的第一个字母和种名种名的头两个字母组成的头两个字母组成3 3个字母的略语表示个字母的略语表示寄主菌寄主菌的物种名，组成酶的基的物种名，组成酶的基本名称。本名称。大肠杆菌（大肠杆菌（E Escherichia scherichia co
16、colili）用）用EcoEco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（H Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae）用）用HinHin表示表示我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2.2. 如果酶存在于一种如果酶存在于一种特殊的菌株特殊的菌株中，则将该菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于位于噬菌体（病毒）或质粒噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母上，则用一个大写字母表示此染色体
17、外遗传成分。表示此染色体外遗传成分。如如 HinHind d ：d d菌株菌株 Eco EcoR R I I ：抗药性：抗药性R R质粒质粒 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物3. 3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序先后次序。 如如HinHind d ：d d菌株中发现的第菌株中发现的第二二个酶个酶4. 4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以所有的限
18、制酶，除以上名称外还要冠以系统名系统名称称。限制性内切酶的系统命名为。限制性内切酶的系统命名为R R，甲基化酶为，甲基化酶为M M。如如 R R. .HinHind d 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 EcoR IEscherichia属名属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号 若种名头若种名头2 2个字母相同则其中一个可用种名的第一和个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。第三个字母。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到
19、愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 目前鉴定出目前鉴定出四种不同类型四种不同类型的限制性内的限制性内切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割切酶。据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为可分为、型。型。 限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物二、限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有
20、修饰酶活性，可分为饰酶活性，可分为、型。型。 主要特性主要特性型型型型型型限制修饰限制修饰 蛋白结构蛋白结构 辅助因子辅助因子 识别序列识别序列 切割位点切割位点双功能（具甲基化）双功能（具甲基化） 异源三聚体异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列距识别序列1kb处处 随机性切割随机性切割单一功能单一功能 同源二聚体同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列回文序列 识别序列内或附近识别序列内或附近特异切割特异切割双功能（具甲基化）双功能（具甲基化） 异源二聚体异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游距识别序列下游24-26bp处处 随机性切割随机性切割基因工程中使用注：注： SA
21、M为为S腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物首先由首先由M.MeselsonM.Meselson和和R.YuanR.Yuan在在19681968年从大肠杆菌年从大肠杆菌 B B株株和和 K K株株分离的。分离的。（1 1）识别位点序列）识别位点序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基本特性 如如 EcoEcoB B和和 EcoEcoK K。未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。N：表示任何
22、一：表示任何一种核苷酸种核苷酸我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）（3）辅助因子辅助因子在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500 bp处处随随机机切开一条切开一条单链单链，不产生，不产生特异片断，特异片断，应用不大应用不大Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点切割位点我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有
23、一个活的生物 首先由首先由H.O. SmithH.O. Smith和和K.W. WilcoxK.W. Wilcox在在19701970年从流年从流感嗜血菌中分离出来。感嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind Hind 未甲基化修饰的双链未甲基化修饰的双链DNADNA上的特殊靶序列（多数是回上的特殊靶序列（多数是回文序列），与文序列），与DNADNA的来源无关。的来源无关。 A B C C B A A B C C B AA B N B AA B N B A 或或型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基本特性 （1 1）识别位点序列）识别位点序列我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和
24、恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 识别位点处。识别位点处。 切开双链切开双链DNADNA。形成粘性末端（。形成粘性末端（sticky endsticky end）或平齐末端（或平齐末端（blunt endblunt end）。如：）。如： EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 产生粘性末端产生粘性末端 EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端产生平齐末端 （2）切割位点切割位点我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西
25、，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A ABCDDNADNAHindHind切割位点核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切割DNA(DNA(识别位点下游识别位点下游24-26bp)24-26bp)，但不是对称的回文顺序，且在识别序列旁边一定数目核苷但不是对称的回文顺序
26、，且在识别序列旁边一定数目核苷酸的位置切割。酸的位置切割。 反应需要反应需要ATPATP、 Mg Mg2+2+和和SAMSAM（S-S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。 型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基本特性 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 IV型限制性内切酶型限制性内切酶 新鉴定出来的一类限制酶。只切割碱基已新鉴定出来的一类限制酶。只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖羟甲基
27、化的被甲基化、羟甲基化、葡糖羟甲基化的DNA序列。序列。 除除EcoKMcrBC外，识别序列尚未确定，外，识别序列尚未确定，目前尚无应用。目前尚无应用。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物核酸限制性内切酶的类型及主要特性核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性特性I型内切酶型内切酶II型内切酶型内切酶III型内切酶型内切酶内切酶的内切酶的蛋白结构蛋白结构3种不同的亚基种不同的亚基单一成分单一成分2种不同的种不同的亚基亚基限制作用限制作用所需要的所需要的辅助因子辅助因子ATP、 Mg2+和和SAMMg
28、2+ ATP、 Mg2+和和SAM寄主特异寄主特异性位点识性位点识别序列别序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC回文序列，回文序列，旋转对称旋转对称 （IIs型除外）型除外）EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物切割位点切割位点在距离识别位在距离识别位点至少点至少1000 bp外随机切外随机切开一条单链。开一条单链。位于寄主位于寄主特异性位特异性位点或其附点或其附近近识别位点识别位点3端端24-26bp处处甲基
29、化作用的位甲基化作用的位点点寄主特异性位寄主特异性位点点寄主特异寄主特异性位点性位点寄主特异性寄主特异性位点位点识别未甲基化的识别未甲基化的序列进行切割序列进行切割能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割 不是不是是是不是不是基因工程中的用基因工程中的用途途无用无用十分有用十分有用用处不大用处不大我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1 1、限制、限制- -修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切
30、酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物识别序列识别序列 识别顺序的碱基数一般为识别顺序的碱基数一般为4-6 bp4-6 bp，少数识别更，少数识别更长，多数识别位点具有旋转对称性长，多数识别位点具有旋转对称性（回文结构），（回文结构），少数的识别位点在切割位点之外，具旋转对称性。少数的识别位点在切割位点之外，
31、具旋转对称性。 4bp Hpa C CGG Hae GG CC 5bpAva G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamHG GATTC SmaCCC GGG11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstX CCANNNNN NTGC 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1 1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。彼此呈碱基互补。2 2、这两股、这两股DNADNA链若按同方向阅读（如链若按同方向阅读（如5 5 3
32、 3），其核苷酸顺序相同。，其核苷酸顺序相同。 5GAA TTC3 3CTT AAG5特点有二：特点有二：回文序列：反向重复序列，双链回文序列：反向重复序列，双链DNADNA中含有两个中含有两个结构相同，方向相反的序列结构相同，方向相反的序列 5GTNAC3 3CANTG5我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物限制性核酸内切酶切割双链限制性核酸内切酶切割双链DNADNA，水解，水解磷酸二酯键中磷酸二酯键中3 3 位酯键产生两个末端，末端位酯键产生两个末端，末端结构是结构是5 5-P-P和和3 3-
33、OH-OH，产生，产生3 3种不同的切口。种不同的切口。 切割方式切割方式 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物与与IIII型核酸内切酶有关的几个概念型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端粘性末端(cohesive ends):(cohesive ends):因酶切位点在两条因酶切位点在两条DNADNA单链上不同（对称）酶切后形成的单链上不同（对称）酶切后形成的具有具有互补碱基互补碱基的的单链末端单链末端结构，酶切产结构，酶切产生的两个粘性末端很生的两个粘性末端很容易容易通过互补碱基通过互补碱基的配
34、对而的配对而重新连接重新连接起来。起来。平平 末末 端端(Blunt end):(Blunt end): 因酶切位点在两条因酶切位点在两条DNADNA单链上相同，酶切后形成的单链上相同，酶切后形成的平齐的末端平齐的末端结构，这种末端结构，这种末端不易不易重新连接起来。重新连接起来。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1. 51. 5突出的末端突出的末端EcoRI等产生的5粘性末端5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 EcoRI
35、37 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-AP OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2. 32. 3突出的末端突出的末端PstI等产生的3粘性末端 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5 PstI 37 5C-T-G-C-A-OH P-G 3 3G- P OH -A-C-G-T-
36、C 5 退火 4-7 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物i i）不同的不同的DNADNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易得多。这比连接两个平齐末端容易得多。粘性末端的意义粘性末端的意义 连接便利连接便利iiii）同一个同一个DNADNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子环形分子。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐
37、怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物粘性末端可以用粘性末端可以用DNADNA聚合酶补平成平齐末端。聚合酶补平成平齐末端。 补平成平齐末端补平成平齐末端B 3B 3末端末端可以通过可以通过末端转移酶末端转移酶添加几个多聚核苷添加几个多聚核苷酸的尾巴（如酸的尾巴（如dAdA和和dTdT），即），即同聚物加尾同聚物加尾造成人工造成人工粘性末端。粘性末端。A A 5 5末端末端可用可用DNADNA多核苷酸激酶多核苷酸激酶进行进行3232P P标记。标记。 末端标记末端标记我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个
38、美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物3. 3. 平头末端平头末端PvuII等产生的平头末端 5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 PvuII 37 5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物平齐末端的特点平齐末端的特点 连接困难，连接困难，连接效率低连接效率低，只有粘性末端
39、连接效率的，只有粘性末端连接效率的1%1%，这种连接常出现，这种连接常出现多联体连接多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法粘性末端与平齐末端连接的处理方法）添补法：）添补法： 利用利用DNADNA聚合酶聚合酶 (klenow fragment）将碱基将碱基添补到目的基因的粘性末端上。添补到目的基因的粘性末端上。）削除）削除( (平平) )法法 利用利用S1S1和和BalBal3131等等核酸酶核酸酶将目的基因粘性末端将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我
40、也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物不同来源的酶，不同来源的酶，识别相同的序列，识别相同的序列，切割方式相同或不同。切割方式相同或不同。识别位点和切点完全相同识别位点和切点完全相同 如如HinHind d 和和HsuHsu I I 同裂酶（同裂酶（Isoschizomer)Isoschizomer) 完全同裂酶：完全同裂酶：我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5识别位点相同
41、，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。如如XmaXma I I 和和 SmaSma I I。 不完全同裂酶：不完全同裂酶：我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物识别的序列不同，但能识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端切出相同的粘性末端。如。如BamBamH IH I、BglBgl 、Bcl Bcl I I、XhoXho 等等 同尾酶同尾酶(Isocaudamers(Isocaudamers）我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的
42、猜测没有错：表里边有一个活的生物 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。Sau 3A我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1 1、限制、限制- -修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对
43、DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物1. 1. 标准酶解体系的建立标准酶解体系的建立 一个单位（一个单位（U U）的限制性内切酶定义：）的限制性内切酶定义： 在合适的温度和缓冲液中，在在合适的温度和缓冲液中，在2020l l的反应体系中，的反应体系中，1h1h完全酶解完全酶解1 1gDNAgDNA所需要的酶量。所需要的酶量。推荐：稍过量的酶（推荐：稍过量的酶（2-52-5倍）和较长的反应时间倍）和较长的反应时间 限制
44、性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物2. 2. 酶解过程酶解过程 配酶解体系配酶解体系 混匀混匀 反应终止反应终止 酶解结果鉴定酶解结果鉴定我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 酶解体系酶解体系一般一般2020l l，保证酶液体积不超过反应总体积的，保证酶液体积不超过反应总体积的10%10%前提下，尽量降低反应总体积。前提下，尽量降低反应总体积。加
45、样顺序一般是：加样顺序一般是：ddHddH2 2O buffer DNA O buffer DNA 酶酶 我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 大部分大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0 - 150 mMDTT1 mM0 - 50 mM 低盐酶低盐酶100 mM 中盐酶中盐酶150 mM 高盐酶高盐酶Volume20 - 100 mlTime Temp 37 1 - 1.5 hr我吓了一
46、跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 混匀混匀移液枪吹打移液枪吹打或或手指轻弹管壁手指轻弹管壁若底物分子很大（如基因组若底物分子很大（如基因组DNADNA），），应避免强烈振荡。应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。暂离心，使管壁液体全部下沉。我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物反应终止反应终止三种方法：三种方法：）加乙二胺四乙酸（）加乙二胺四乙酸
47、（EDTAEDTA）至终浓度）至终浓度 10mmol/L; 10mmol/L; 加十二烷基硫酸钠（加十二烷基硫酸钠（SDSSDS） 至终浓度至终浓度0.1%(W/V)0.1%(W/V)）6565加热加热20min20min或者或者7070加热加热10min10min）酚）酚/ /氯仿氯仿抽提抽提我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 酶解结果鉴定酶解结果鉴定快速进行微型琼脂糖凝胶电泳快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察观察然后决定是否终止反应然后决定是否终止反应我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为
48、什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 完全消化完全消化：内切酶在：内切酶在DNA上的上的所有所有识别位点都被切开。识别位点都被切开。 局部消化局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。：只有有限数量的酶切位点被切开。 通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。达到局部消化的目的。 我吓
49、了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物酶切后发现除了目的酶切后发现除了目的DNADNA条带外，还有其它条带条带外，还有其它条带 造成非特异性切割；造成非特异性切割； 不正确的操作，导致其它内切酶污染；不正确的操作，导致其它内切酶污染； 底物底物DNADNA中可能存在其它中可能存在其它DNADNA污染。污染。电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常 底物底物DNADNA不纯；不纯； 内切酶不纯；内切酶不纯； 酶蛋白自身或其它杂蛋白与酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNAD
50、NA结合在一起使电结合在一起使电泳条带移动距离异常泳条带移动距离异常我吓了一跳，蝎子是多么丑恶和恐怖的东西，为什么把它放在这样一个美丽的世界里呢？但是我也感到愉快，证实我的猜测没有错：表里边有一个活的生物 DNA中的杂质如蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙中的杂质如蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、醇、SDS、EDTA、NaCl等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。 1. DNA的纯度的纯度 一一般般采采取取 纯化纯化DNA 加大酶的用量加大酶的用量 （510U酶酶/ g DNA ） 延长保温时间延长保温时间 （34h） 扩大反应体积，使潜在的抑制因素被稀释（扩大反应体积，使潜在的抑制因素被稀释（