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1、Four short words sum up what has lifted most successful individuals above the crowd: a little bit more.-author-date脂质体转染实验原理与操作步骤总脂质体转染的实验原理与操作步骤大全脂质体转染的实验原理与操作步骤大全日期：2012-06-25 来源：互联网 作者：青岚 点击：3644次摘要：细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转
2、染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。找产品，上生物帮 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-1-2，3-Dioleyoxy， Propyl-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物1：1(w/w)
3、。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从15g和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(224小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat
4、等任何一种细胞均可作为受体细胞。一、脂质体(liposome)转染方法原理脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体(Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电 的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。二、脂质体转染操
5、作步骤1、操作步骤方法一：(1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含12105个细胞培养液，37CO2培养至40%60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。(2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10g DNA，终量100L，B液：用不含血清培养基稀释2-50gLR，终量100L，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。(3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。(4)转
6、染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37温箱置624小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。2、快速脂质体转染法操作步骤如下方法二：(1)以5105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到5060%板底面积。(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。室温下放置510分钟，使DNA结合在脂质体上。(3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后
7、弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37培养35小时。(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养1424小时，(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养2448小时。(6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。3、稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37培养48小时。(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆
8、筛选法进行。三、个人经验：本人用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板转染单层贴壁细胞。(别的方法可以参考生产商提供的protocol)1、转染前1天将0.52105细胞接种于24孔培养板，并加入500ul不含抗生素的完全培养基，以保证转染时细胞汇合达9095%。2、准备复合物(1) 将0.8ug DNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。(2) 将2ul Lipofectamine2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中，轻轻浑匀，室温孵育5分。注意：必须在25分内进行。(3) 5分后将它们混合，并轻轻浑匀，室温孵育20分。3、吸去培养板
9、的培养基，用PBS或无血清培养基(最好)清洗细胞2次。4、将复合物(总体积100ul)加入培养孔，前后摇动培养板使其分布均匀。5、将细胞放入培养箱孵育46h后，可以更换含血清培养液去除复合物(也可不用)。6、2448h后可以观察转入基因表达情况。7、稳定转染：换含血清培养基24h后将细胞以1：10(或更高比例)传代，1天后更换筛选培养基筛选。8、优化：要保证细胞汇合率达9095%(比较高);DNA/ Lipofectamine2000比率1：0.51：5，一般细胞1：23.脂质体转染法的主要优点是可用将DNA转染至悬浮或者铁壁细胞培养、转染效率相对较高、对基因片段大小的限制较小等，但是阳离子脂
10、质体对细胞的毒性相对较高，为了防止其毒性，要摸索好如下实验条件：脂质体与质粒的比例、细胞转染时间等。脂质体是由脂双分子层组成的颗粒，可介导基因穿过细胞膜。通过脂质体介导比利用病毒转导进行基因转移具有以下明显的优势：脂质体与基因的复合过程比较容易；易于大量生产；脂质体是非病毒性载体，与细胞膜融合将目的基因导入细胞后，脂质即被降解，无毒，无免疫原性；DNA或RNA可得到保护，不被灭活或被核酸酶降解；脂质体携带的基因可能转运至特定部位；体外和体内试验都表明，接近染色体大小的DNA片段也能被转运至宿主基因组中并增长；转染过程方便易行，重现性好。脂质体是具有双层膜的封闭式粒子，自身聚集性脂类分子包封内水
11、相介质，可分为大、小多层，寡多层和单室脂质体，医学应用较多为小单室脂质体。基于脂质体作为药物载体系统的经验，理想的用于转运基因的脂质体，对于质粒DNA具有高包封率，保护DNA不被血浆核酶降解的特点，它们粒径分布范围窄，粒径平均为100 nm或者更小。为使脂质体接近血管外区域，故采用具有广泛的结合潜力脂类，这种特殊脂类可促进与细胞膜融合和/或提高脂质体在循环系统中的稳定性。第1种为传统上的脂质体，人们可控制其体外行为，但不能控制其体内行为，它们很快被灭活或被固定；第2种为无活性脂质体（即不与外界作用），由于聚合物包封于表面的立体稳定性而抑制其相互作用；第3种脂质体表面结合抗原、凝集素或其他基团，
12、由于表面结合的特定配基，也可特定地相互作用；第4种为反应活性脂质体，如离子型、靶敏感型和融合性脂质体，这种脂质体有时指相转变的多孔脂质体，脂质体内有离子敏感亚基，Ca2+其他金属离子敏感性脂质体，也包括阳离子脂质体，阴离子脂质体。阴离子脂质体不属于有反应活性类，但特殊的试验如试管内与相反电荷（多）离子相互作用例子除外。常规脂质体进入细胞转运DNA实验，其原理是脂质体增强细胞体的聚集，即加速大分子、荷电多的分子透过膜，该过程相当复杂，尤其在包封较大片段时，在实践中这种技术只在体外使用且要用融合剂，荷电越多用途越少。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部。-